چینه و فسیل شناسی

راهکارهای مقابله با تنش خشکی در گیاهان

به طور کلاسیک، راهکارهای مقاومت گیاهان در مقابل تنش خشکی به سه بخش فرار، اجتناب و مقاومت تقسیم می­شود (لویت، 1972؛ تورنر، 1986).ولی هنوز این راهکارها متقابل و منحصر نیستند و در عمل، گیاهان ممکن است محدوده­ای از انواع پاسخ­ها را نشان دهند (لودلاو، 1989). گیاهان فرار کننده از خشکی پیشرفت زیادی در شکل پذیری از خود نشان می­دهند، که توانایی تکمیل چرخه برگهای­شان را قبل از وقوع تنش کم آبی فیزیولوژیکی دارند. استراتژی فرار نقش بسزایی در تولید قبل از وقوع تنش شدید دارد که این امر در مناطق خشک و جاهایی که چرخه برگ بر اثر سرعت بالای رشد و تبادل انرژی، حداکثر استفاده از منابع در دسترس تا زمانی که رطوبت در خاک وجود دارد کوتاه می­شود، می­تواند اهمیت بالایی داشته باشد( مونی و همکاران، 1987؛ مارکو و همکاران، 2000). بهبود موثر در امر تولید شامل تقسیم هر چه بهتر اسیمیلات­ها برای توسعه گیاهان است. که این امر در ارتباط با توانایی گیاه در ذخیره اسیمیلات­ها در چند ارگان (ساقه­ها و ریشه­ها) و انتقال مجدد آنها جهت تواید محصول، که یک پاسخ به خوبی مستند در گیاهان زراعی از قبیل غلات (گبینگ و چنیدر، 1999؛ بروس و همکاران، 2002) و بعضی از لگوم­ها (رودریگز و همکاران، 1995؛ یانگ و همکاران، 2002) است. که این توانایی در گیاهان تحت تنش خشکی افزایش یافته است (رودزیگر و همکاران، 1995؛ یانگ و همکاران، 2001).

همچنین گیاهان می­توانند شرایط خشکی را با اجتناب از پسابیدگی بافت­ها در زمانی که حفظ پتانسیل آب بافت­ها بالاتر از حد ممکن است یا با تحمل چتانسیل آب پائین بافت تحمل کنند. اجتناب از پسابیدگی پاسخی عمومی و همیشگی و در ارتباط با یک واریته دارای صفات سازگار می­باشد. که شامل:1- از دست دادن حداقل آب2- حداکثر جذب آب، است.

     از دست دادن حداقل آب از طریق بسته شدن روزنه­ها، کاهش جذب نور از طریق لوله­ای شدن برگ­ها (الرینگر و کوپر، 1992)، لایه کرکی فشرده که انعکاس نور را افزایش می­دهد (لارچر، 2000) یا تغییر زاویه برگ یا بوسیله کاهش سطح برگ کانوپی از طریق کاهش رشد و ریزش برگ­های مسن­تر امکان­پذیر است. حداکثر جذب آب از طریق تنظیم و تخصیص الگو­ها برای مثال، افزایش سرمایه گذاری در ریشه­ها (جکسون و همکاران، 2000) امکان پذیر است. دست آوردهای چشمگیر در تولید گیاهان زراعی محدود به گیاهان اصلاح شده برای مناطق خشک و نیمه­خشک است که خود از افزایش در عمق ریشه منتج شده­اند (فیشر و تورنر، 1978؛ بلام، 1984). بعلاوه ریزش برگ­های پیر که می­تواند به صورت یک برنامه چرخه­ای در گیاهان در نظر گرفته شود، توزیع و تخصیص مواد غذایی ذخیره شده در برگ­های جوان می­تواند به ذخیره آب کمک کند. در طول پیری القا شده در اثر تنش خشکی، برخی فرآیندها که ویژه خشکی هستند و تحت شرایط طبیعی رخ نمی­دهند به خاطر بعضی از پروتئین­های سیستئینی است (خانا-کوپرا و همکاران، 1999). به نظر می­رسد که گونه­های حساس و مقاوم تفاوت بیشتری در برانگیزش تحت تنش خشکی در اثر فعالیت آندوپروتئولیتیک پروتئین­ها دارند (پروتئازهای آسپارتیک) این انگیزش در گونه حساس بالاتر از گونه مقاوم است (کروز دکاروالهو و همکاران، 2001).

     اطلاعات بیشتر از این فرآیندها، ممکن است منجر به توسعه اصلاح گیاهان یا راهکارهای مهندسی ژنتیک جهت جلوگیری از پیری برگ در اثر تنش خشکی شود. پیری برگ، منجر به ذخیره اندک مواد قندی شده، که به عنوان یک فاکتور مهم در سقط جنین گیاه تحت تنش خشکی است. بنابراین فنوتیپ­هایی که در آنها پیری القا شده در اثر تنش خشکی به تاخیر افتاده شود ممکن است موجب مرغوبیت محصولاتی شود که عملکرد، منبع محدود شده در آنهاست (لوی و همکاران، 19997) و ذخیره بالای ساقه و استفاده از آن در ذخیره و رشد محصولات تحت تنش­ ناچیز است.

     آن چه اهمیت بالاتری نسبت به اجتناب از خشکی دارد پاسخ فعال گیاه به تنظیم منابع ناچیز یا حداقل است (آب و عناصر غذایی) (لامبرز و همکاران، 1998؛ پورتر و ناجل، 2000). در حقیقت، با توجه به کاهش در آب در دسترس، خاک خشک شده و موجب القای کاهش در مواد غذایی و میزان نیتروژن (همچنین کلسیم)، با اثرات زیادی روی رشد و عملکرد گیاهان می­شود (مک دونالد و دیویس، 1996). این یک زمینه بسیار مهم جهت تحقیق و ابداع روش­های مورد نیاز جهت آزمایش بخش­های مختلف اثرات ایجاد شده توسط کمبود آب و عناصر کم مصرف تحت تنش خشکی است. عناصر تنظیم کننده منابع حداقل گیاهان در مناطق خشک موجب تغییر در ساختار برگ، افزایش پروتئین­های اولیه تجمع و تخصیص عناصر غذایی به ریشه­ها (پورتر و ناجل، 2000)، کاهش سرعت رشد و کاهش سرعت واژگردی بافت (بزاز وگریس، 1997) می­شود. در حالی که بافت­های با طول عمر کم می­تواند در پاسخ به تنش حذف گردند و بافت­های با طول عمر طولانی باید منابع مورد استفاده­شان را بهینه کنند. تغییر در دموگرافی برگ موضوعی است که در گونه­های همیشه بیابانی Cryptantha flava گزارش شده است که در اثر تنش خشکی طول عمر برگهایشان دو برابر می­شود (کاسپر و همکاران، 2001). که این پاسخ در نتیجه سرعت پائین واژگردی برگ­ها و استفاده از عناصر غذایی ضروری در مقدار بالا است، همچنین نشان می­دهد که گیاهان به طور جزئی می­توانند سرعت پائین دریافت مواد قندی را بوسیله کاهش برگ­های جدید جبران کنند.

     در نهایت، مقاومت بافت به پتانسیل آب پائین ممکن است سلول­های دیواره که سفت و سخت هستند یا سلول­های کوچک را با تنظیمات اسمزی درگیر کند (ویلسون و همکاران، 1984). مقاومت به پتانسیل آب پائین بیشتر درختان همیشه سبز و دیگر درختان مناطق خشک و نیمه­خشک دارای مواد محلول با غلظت بالا در سلول­های زنده خود (پتانسیل اسمزی پائین) با اسکلروفیلی، ظرفیت فتوسنتزی و هدایت روزنه­ای پائین هستند دیده می­شود (ناریا و همکاران، 1998). به هر حال این موضوع  همه­گیر نیست، زیرابرخی از گونه­های اوکالیپتوس و Banksia که دارای برگ­های اسکلرومورفیک هستند سرعت بالایی از فتوسنتز را نسبت به سطح برگ نشان می­دهند (لامبرز وهمکاران، 1998).

برگ­های کوچک به خوبی به نور و دمای بالا سازگاری پیدا می­کنند که این امر موجب فایق آمدن بر بسیاری از شرایط در مناطق خشک می­شود، زیرا اندازه آنها و حساسیت بالا به اتلاف گرما و بسته شدن روزنه­ها موجب کنترل موثر هدر رفت آب توسط گیاهان می­شود.

     یکی دیگر از استراتژی­های گزارش شده عبارت است از زنده مانی گیاهان در فصول خشک بوسیله دورمانسی ناقص است. که برای مثال، در لگوم­های همیشه سبز مثل Retama raetamدیده می­شود (میتلر و همکاران، 2001). در این گیاهان دورمانسی وسیله­ای برای ممانعت از بیان ژن (کد شدن ژن) پروتئین­های فتوسنتزی است. پس از بارندگی، پروتئین­های مذکور در عرض 24-6 ساعت سنتز می­شوند. مقاومت به خشکیدگی بیش از حد در قارچ­ها، گیاهان احیا شونده (رستاخیز) و همانند آن در سرخس­ها، گیاهان غیر آوندی، جلبک­ها و گلسنگ­ها مشاهده شده است. روزنه برگ­های گیاهان رستاخیز می­توانند بسته به رطوبت و شرایط آب و هوایی حدود (v/v) 2%-0 بسته شوند، در حالی  که توانایی فتوسنتزی خود را در پسابیدگی بالا نیز حفظ کنند. تغییرات ناگهانی در RNA پیامبر (mRNA) و سطوح پروتئین منجر به مقاومت گیاه می­شود (اینگرام و بارتلز، 1996).

احساس تنش خشکی (Sensing drought stres)

تعیین اینکه گیاهان چگونه کمبود آب را احساس می­کنند خود یک کمپلکس است. پیام­های مختلفی ممکن است برای فرآیندهای مختلف، (برای مثال روزنه­ها ممکن است به برخی از پیامها مانند توسعه سلول یا پیری برگ پاسخ ندهند) بعلاوه اطلاعات دقیقی از موقعیت ایجاد پیام و احساس آن در فرایندهای ترارسانی علامت در سلول یا بافت بدست آمده است. در نهایت، ژنها فعال یا غیر فعال خواهند شد و تغییرات فیزیولوژیکی شکل خواهد گرفت  که منجر به شکل گیری یک برنامه جهت توسعه گیاه می­شود. ولی تنظیم کننده­های اولیه فرآیندهای سلولی از جمله وضعیت آب، فشار تورگر، پیوندهای آب، هورمونها (برای مثال هورمون آبسیزیک اسید)، جایگزینی در غشای سلول و دیگر فرایندها هنوز در دست تحقیق و بررسی هستند. همچنین مشخص شده که یک همبستگی بین تنش­های غیر زنده و مسیرهای ترارسانی علامت وجود دارد (بطور جزئی از طریق تولید ROSها) بویژه در زمان وجود تنش خشکی، برای مثال در زمان­­های شروع تنش احساس می­شود (نایت و نایت، 2001).

     ترارسانی علامت می­تواند به صورت موضعی و یا با فاصله طولانی باشد. علامت­دهی از ریشه­ها تاساقه نیازمند ترکیبات شیمیایی یا پیام­های فیزیکی است که از طریق گیاه در پاسخ به تنش­های احساس شده در ریشه منتقل می­شود. این پیامها ممکن است مثبت، در اثر ترکیباتی که در جریان آوندهای آبکش اضافه می­شود یا منفی، در حالتی که بعضی از ترکیبات دورتر از جریان ساقه جذب شوند ( یا تولید نشوند). اگر سلولها به تغییر در فشار هیدرولیک، سپس فشار حفره آوند آبکش و در درون پاسخ دهند ممکن است به ایجاد پیام هیدرولیکی کمک کنند.

     اهمیت همبستگی بین پیام­های شیمیایی و هیدرولیک در تنش خشکی گاهی اوقات تحت بحث و بررسی بوده است. این موضوع اهمیت بالایی در کنترل حفره روزنه­ها و تنظیم تعرق، جایی که هر دو نوع پیام ذکر شده (شیمیایی و هیدرولیکی) کمک مشابهی دارند (کامستوک، 2002)، خواهد داشت.

     از دست دادن آب بوسیله تعرق ممکن است مستقیما بر روی توسعه سلولی تاثیر بگذارد، زیرا تغییر در فشار تورگر در سلول­ها رخ می­­دهد، اما این بهترین حالت دریافت پیام توسط سلولهاست و فاکتورهای دیگر برای تعیین توسعه سلولی ضروری خواهند بود (پروسئوس و همکاران،1999). اولین گام در شکل گیری یک پاسخ مولکولی در پاسخ به پیام محیطی (از قبیل کمبود آب) و احساس آن بوسیله گیرنده­های ویژه­ای صورت می­گیرد. فعالیت بیش از حد (یا سرکوب) این گیرنده­ها موجب شروع یک پاسخ آبشاری برای انتقال اطلاعات از طریق مسیر ترارسانی علامت خواهد شد. اطلاعات اولیه در مورد مسیر ترارسانی علامت از مخمر بدست آمده نشان می­دهد که احساس کمبود آب از طریق هیستیدین کینازهای ترابری غشا که کنشی شبیه به یک اسموسنسور دارند، میانجیگری می­شود (پوساس و همکاران، 1996). یورائو و همکاران (1999) نشان داند که تنش خشکی در نتیجه تنش اسمزی بوجود می­آید که باعث بیان اسموسنسور AtHTK1 کلون شده در آرابیدوپسیس می­شود. AtHTK1 یک دومین هیستیدین کینازی است، یک دومین دریافت کننده و دو دومین انتقال دهنده غشایی ممکن است به عنوان اولین ترکیبات حس کننده تغییرات در پتانسیل اسمزی اطراف سلول و باعث علامت­های آبشاری در پائین دست ژن شوند که در نهایت منجر به بیان ژنهای القا شونده تحت پسابیدگی می­شوند (یورائو و همکاران، 1999).

     اخیرا کلون ژن انتقال دهنده یون پتاسیم (k+) در اوکالیپتوسEucalyptus camaldulensis)) (ECHKT) که فعالیت­هایی مشابه به (AtHTK1) در احساس تغییرات اسمزی در غلظت محلول محیط بیرونی نشان داده است، سازگاری و پیوستگی زیادی با این فرضیات دارد. یورائو و همکاران (2000) واسطه­گرهای تقویت کننده پتانسیل فسفری -3 (ATHP1-3) و تنظیم کننده­های پاسخ-4 را که ممکن است در مراحل بعدی احساس تنش اسمزی درگیر باشند را کلون کرده­اند.

غشای سیتوپلاسمی و نقش آن در احساس تنش خشکی

یکی از اثرات برجسته تنش، پراکسیداسیون لیپید­ها و فقدان غشا به دلیل بالا رفتن مقدار (ROS) می­باشد (هرناندز و همکاران، 2000؛ سیرام و همکاران، 2002). گیاهان آنزیم­ها و ترکیبات آنتی­اکسیدان خاصی برای مهار این ROSها دارند که دارا بودن ظرفیت بالای تولید آنها در ارتباط با متحمل بودن گیاه است (اشرف و علی، 2008). پایداری و ثبات غشا سلولی برای مدت زمان زیادی است که به عنوان شاخص تحمل به استرس در گیاهان شناخته شده است. پایداری غشای سلولی تحت تنش خشکی در گیاهان زیادی مانند گندم و گونه­های وحشی آن (فروق و اعظم، 2002)، ذرت (پراماچاندرا و همکاران، 1989) و برنج (تریپاتی و همکاران، 2000) به کار رفته است. با این وجود، این معیار اخیرا در گیاهان تحت تنش شوری مانند گندم (سیرام و همکاران، 2002؛ فروق و اعظم، 2006) و کلزا (اشرف و علی، 2008) مورد استفاده قرار گرفته است.

این امکان وجود دارد که در طول پیشرفت تنش خشکی واکنش­های کاتیونی و آنیونی مواد آمفیفیلیک با غشای پلاسمایی منجر به تغییر در موقعیت فیزیکی یا واکنش­های لیپید-پروتئین غشاهایی شوند، که بوسیله سلول­هایشان احساس تنش اسمزی را تقویت می­کنند. یکی از این مکانیسم­ها که اخیرا در Lactococcus lactisبررسی شده فعالیت انتقال دهنده آبسیزیک اسید تنظیم کننده اسمزی OpuA است که بوسیله تغییرات خواص و واکنش­های لیپید-پروتئین غشا صورت می­گیرد (هید و پولمن، 2000 ؛ وود، 1999). معنی­دارترین تغییرات در حالت فیزیکی غشا ممکن است فعالیت اکثر پروتئین­های درون غشایی را که در کنترل حجم سلول یا هموستازی فشار تورگر درگیرند را تنظیم کند (تیرمن و همکاران، 2002). بیان ژنهای این گروه از پروتئین­ها تحت تاثیر تنش­های آبی و اسمزی است (کاوازاکی  و همکاران، 2001 ؛ موریلون و کریس پیلز، 2001 ؛ تیرمن و همکاران، 2002). به هر حال، مطالعهcrystallinumMesembryanthemum (گیاه محلی مناطق سرد) نشان داده که فاکتورهای تغییرات پس از رونویسی و یا تغییرات پس از ترجمه ممکن است نقش بسیار مهمتری در تنظیم کانال­های آبی نسبت به بیان ژن داشته باشند (کیرچ و همکاران، 2000 ؛ تیرمن و همکاران، 2002).

ترارسانی پیام (Signal transduction) تنش خشکی

آبشارهای ترارسانی علامت از محل دریافت پیام­های تنش خشکی موجب بیان انواعی از ژن­ها و مولکول­های علامت­دهی می­شوند که آنها نقشی در آبشارهای مطالعه شده در گیاهان و تحقیقات مرتبط با آن ندارند. بسته شدن روزنه­ها یکی از صفاتی است که به عنوان سیستم مدل در پاسخ سلول­های گیاهی به تنش کمبود آب است (کارنز و اسمن، 1993 ؛ گیرودت و همکاران، 1994). در طول بسته شدن روزنه­ها میزان یون کلسیم (ca²⁺) سیتوپلاسمی افزایش می­یابد، فرض بر این است که ca²⁺ به عنوان یک پیک ثانوی در پاسخ به تنش اسمزی است. در سلول­های حیوانی، اینوزیتول 1و4و5 تری فسفات IP3))  در تشخیص ca²⁺ در داخل سیتوپلاسم از ذخیره­های داخل سلولی اهمیت دارد و ممکن است نقش مشابهی در سلول­های گیاهی داشته باشد. ca²⁺ وIP3  به احتمال زیاد به عنوان پیک­های ثانوی کاندید در پاسخ به تنش خشکی در سلول­های گیاهی هستند ( کوته، 1995).

فرآیندهای فسفریلاسیون نقش مهمی در آبشارهای ترارسانی علامت­ در گیاهان مختلف، مخمرها و حیوانات دارند. انواع مختلفی از پروتئین کینازها در گیاهان گزارش شده­اند که در فرآیند­های فسفریلاسیون مسیرهای مختلف ترارسانی علامت از قبیل تنش خشکی و پاسخ­هایABA  نقش دارند (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 1996).رونویسی ژن­ها از طریق برهم کنش پروتئین­های تنظیمی (عوامل رونویسی) با توالی­های تنظیمی ویژه در پروموترهای ژن­های مورد تنظیم کنترل می­شود. ژن­های مختلفی که توسط علایم یکسانی (برای مثال خشکی یا شوری) القا می­شوند توسط یک مسیر علامت دهی مشترک که منجر به فعال­سازی این عوامل رونویسی اختصاصی می­شوند، نظارت می­گردند. مطالعه پروموترهای چندین ژن­ القا شونده با تنش منجر به شناسایی توالی­های تنظیمی ویژه برای ژن­های دخیل در تنش­های مختلف شده است. برای مثال، ژنRD29  دارای توالی­هایی است که می­تواند توسط تنش اسمزی، سرما و ABA فعال شود.پس از اولین مشاهدات رخ داد تنش، پاسخ­های وابسته به خشکی از سلول به اندام از طریق مسیرهای متفاوتی مثل مسیر وابسته به آبسیزیک اسید (ABA) و مسیر مستقل از آبسیزیک اسید انتقال پیدا می­کند. در مسیر وابسته به ABA تجمع آبسیزیک اسید، ژنهای وابسته به تنش متفاوتی را فعال می­کند که بعضی از آنها در سازگاری به تنش تشخیص داده شده­اند. تولیدات این ژن­ها ممکن است نقش عملکردی (از قبیل آکواپورین­ها یا آنزیم­هایی که در تشخیص تنش اسمزی بیوسنتز می­شوند) یا نقش تنظیمی (از قبیل پروتئین کینازها) داشته باشند. اگر چه اطلاعات کمتری از مسیر مستقل ازABA وجود دارد، اما مشخص شده است که به طور ناگهانی در اثر تنش خشکی القا می­شود. بنابراین، مسیرهای وابسته و غیر وابسته به ABA معمولا برای ساختارها و غیر وابستگی هر کدام از آنها مطالعه شده است. البته کایزیس و همکاران (2001) پیشنهاد کرده­اند که این امکان وجود دارد که برخی از () از بین آنها خارج شوند.

شکل 1-2 نحوه احساس و مسیرهای ترارسانی در تنش خشکی (چاوز و همکاران، 2003)

 

پاسخ­های میانجی­گری شده باABA به تنش خشکی

پروموترهای ژنهای تنظیم شونده باABA  دارای یک عنصر توالی 6 نوکلئوتیدی معروف به عنصر پاسخ به ABA ([1]ABRE) است که احتمالا به عوامل رونویسی دخیل در فعال سازی ژن تنظیم شونده  باABA  متصل می شود. پروموترهای این ژنها که توسط تنش اسمزی به  یک شیوه وابسته به ABA تنظیم می­شوند دارای یک عنصر توالی تنظیمی 9 نوکلئوتیدی جایگزین به نام عنصر پاسخ به خشکیدگی (DRE)[2] است که توسط یک دسته جایگزین از پروتئین­های تنظیم کننده رونویسی شناسایی می­شود. بنابراین ژن­هایی که توسط تنش اسمزی تنظیم می­شوند ظاهرا توسط مسیرهای ترارسانی علامت با واسطه عمل ABA (ژنهای وابسته بهABA) یا توسط یک مسیر مستقل از ABA، مسیر ترارسانی علامت حساس به تنش اسمزی تنظیم می­شوند.تنش خشکی، سرما و شوری بالا بسیاری از ژن­های پاسخ به ABA را القا می­کنند (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 2000). زیرا پروموتر این ژن­ها حاوی موتیف­های دیگری هستند که آنها را عناصر پاسخ به ABA یا ABRE می­نامند. این موتیف­های ABRE جایگاه­های اتصال هدف برای فاکتورهای رونویسی b-zip هستند (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 2000). (شکل1). القای ژن rd29B آرابیدوپسیس در اثر تنش خشکی و تنش شوری و پاسخ آن­ها به خشکی نیازمند ABA درونی است که این امر در موتانت­هایی که نقص در ترارسانی یا بیوسنتز ABA دارند به شدت ممانعت می­شود. ناحیه پروموتری این ژن­ها، اگر چه ، فاقد عناصر تکرار C یا DRE است اما داشتن دو کپی از ABRE و تقویت کامل با آن­ها موجب القای این ژن­ها توسط ABA می­شود. در حقیقت، ژن rd29Aحاوی هر دوی عناصر تکرار C/ DRE و عناصر پاسخ به ABA (ABRE) است. بنابراین می­تواند میسرهای ترارسانی محرک­های ورودی از قبیل سرما، خشکی، شوری بالا و ABA را ادغام کند. (شکل 1). در واقع به علت اینکه این پروموترها پیام­های تنشی زیادی را ادغام می­کنند، می­توانند به عنوان یکی از قدرتمندترین ابزار گزارش کننده در تشخیص جهش­های موثر در ترارسانی علامت تنش سرما و شوری باشند (ایشی تانی و همکاران، 1997؛ زانگ و همکاران، 1999).

دومین مسیر وابسته به ABA از طریق تجزیه و تحلیل ژن rd22 و دیگر ژن­های پاسخ به تنش خشکی مشخص شده است (شینوزاکی ویاماگوچی شینوزاکی، 1993). (شکل 1). موتیف­هایی که توالی­های MYB و MYC را تشخیص می­دهند برای القای بیان این ژن توسط ABA و تنش خشکی ضروری هستند، بعلاوه، القای فاکتورهای رونویسی MYB و MYC توسط ABA ممکن است نقش مشارکتی در بیان ژن وابسته به ABA، rd22 داشته باشند (یورائو و همکاران، 1993؛ ابی و همکاران ،1997، 2003). القای فاکتورهای رونویسی جفت شده با موتیف­های تنظیمی متفاوت در پروموتر ژن­های هدف در زمان­های متفاوت، یک روش ابتکاری را در تعیین مدت زمان و ادغام شبکه­ها در سازگاری به تنش ارائه می­دهد (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 2000).

فوجیتا و همکاران (2004) ژن RD26 را از cDNA آرابیبدوپسیس تالیانا جدا کردند، این ژن پروتئین NAC را کد می­کند. بیان ژن RD26 نه تنها توسط خشکی بلکه توسط ABA و تنش شوری بالا نیز القا می­شود. گیاهان ترانسژنیک با فوق بیان در ژن RD26 حساسیت بالایی به ABA دارند و زمانی که این ژن سرکوب می­شود گیاهان به ABA غیر حساس می­شوند. نتایج حاصل از بررسی­های ریزآرایه­ای نشان می­دهد که بیان ژن­های القا پذیر از تنش و ABA در گیاهانی که فوق بیان ژن RD26 را دارند افزایش یافته و در گیاهانی که بیان ژن RD26 سرکوب شده، بیان این ژن­ها نیز سرکوب شده است. بعلاوه، این ژن موجب فعال شدن پروموتر ژن­های هدف در پروتوپلاست­های آرابیدوپسیس شده است. این نتایج نشان می­دهد که کنش ژن RD26 به عنوان یک فعال کننده رونویسی در بیان  ژن­های القا پذیر از ABA تحت تنش­های غیر زیستی در گیاهان است.

پاسخ­های مستقل ازABA به تنش خشکی

     حداقل 2 مسیر علامت دهی در تنظیم بیان ژن به شیوه مستقل از ABA دخالت می کند. عامل­های رونویسی عمل کننده مقابل^[3](که DREB1 و DREB2 نامیده می­شود) که در پروموترهای ژن­های حساس به تنش، به عناصرDRE  متصل می شوند ظاهرا توسط یک آبشار علامت دهی مستقل از ABA فعال می­گردند.سایر ژن­های مستقل از ABA و حساس به تنش اسمزی ظاهرا مستقیما توسط آبشار علامت دهی MAP کیناز معروف نظارت می­شوند. به نظر می­رسد که سایر تغییرات در بیان ژن از طریق سازوکارهای دیگری بدون مداخله DREBها میانجی­گری شوند (تایز و زایگر،2002).

پسابیدگی سلول موجب القای چندین ژن در موتانت­های دارای کمبود و غیر حساس به ABA می­شود. پیشنهاد شده است که برخی از ژن­ها برای بیان شدن خود نیاز به ABA ندارند (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 1997 ؛ لوآن، 1998). ژن­های غیر وابسته به ABA، عناصر پاسخ به پسابیدگی محافظت شده (با یک توالیDER, TACCGACAT) در ناحیه پروموتری خوددارند که در تنظیم ژن بوسیله واکنش با یک آبشارعلامت­دهی غیر وابسته به ABA درگیر هستند.

در آرابیدوپسیس دو گروه از فاکتورهای رونویسی که به صورت سیس به DER متصل می­شوند کلون و مشخص شده­اند (نایت و نایت، 2001). ژن­های cbf1 (یا dreb1) و cbf2 (یا dreb2 ) پروتئین­های ساختاری متفاوتی که به DER متصل شده، اما توسط تنش­های غیرزیستی متفاوتی القا می­شوند را کد می­کنند. تنش سرمایی (دمای پائین) و تنش کمبود آب رونویسی ژنcbf1 (ستوکینگر و همکاران، 1997) و رونویسی ژن dreb2 توسط تنش خشکی و تنش اسمزی القا می­شود (لیو و همکاران، 1998). دو گونه مشابه از ژنDREB2 که اختصاصیت بافتی متفاوتی نشان داده­اند، کلون شدند. ژنdreb2Aتنها در ریشه و در پاسخ به شوری بیان می­شود ولی ژنdreb2B در ساقه و در پاسخ به تنش خشکی بیان می­شود (ناکاشیما و همکاران، 2000). به نظر می­رسد که عناصر پروموتر DRE به عنوان یک محل تقاطع در جایی که مسیرهای علامت­دهی متفاوتی توسط تنش­های غیرزیستی بوجود آمده باعث تبادل اطلاعات و پاسخ به چندین تنش می­شود (نایت ونایت،2001).

     تشخیص مسیرهای وابسته و مستقل ازABA ممکن است در پائین دست اولین تنش مشخص شده و رخدادهای علامت­دهی اتفاق افتد، و یا ممکن است ژن دارای هر دوی عناصر DRE و ABRE در ناحیه پروموتری خود باشد. برای مثال، در آرابیدوپسیس تنظیم ژن rd29A(که حاوی DRE و ABRE) در اولین ساعات پسابیدگی، مستقل ازABA ولی در مراحل بعدی بیان خود وابسته به ABA است (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 2000). به طور مشابه ژن dreb1 یک موتیف حفاظت شده دارد که در عناصر پاسخ به اتیلن ژنهای خانواده پاسخ به اتیلن یافت می­شود (استوکینگر و همکاران، 1997 ؛ شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی، 2000).

در بررسی ژنوم برنج هومولوگ ژن­های CBF/ DREB1 و DREB2 در برنج به ترتیب 10 عدد OsDREB1 و 4 عدد OsDREB2 مشخص شده­اند. کنش این ژن­ها در بیان ژن القا پذیر از تنش در برنج نشان داده شده است. فوق بیان ژن OsDREB1 در آرابیدوبسیس نشان از کنش مشابه ژن­های برنج در بیان ژن پاسخ به تنش و مقاوم به تنش دارد (دبوزت و همکاران، 2003). اخیرا فوق بیان ژن OsDREB1 یا DREB1آرابیدوبسیسموجب افزایش مقاومت به خشکی و سرما در برنج شده است (ایتو و همکاران، 2006). این نتایج کنش مشابه عامل­های رونویسی را در مقاومت به تنش­های غیر زیستی بین گیاهان تک لپه و گیاهان دو لپه نشان می­دهد.

چربی­ها و ترارسانی:

مقاومت گیاهان به تنش خشکی نتیجه سازگاری­های مورفولوژیکی و پاسخ در سطح ژنتیکی و بیوشیمیایی است. از بین تمام مکانیسم­های سازگار در گیاهان در برابر تنش خشکی، مقاومت در سطح سلولی ضروری به نظر می­رسد زیرا، این مکانیسم­ها به گیاهان اجازه می­دهند تا هموستازی سلولی را حفظ کنند. در حقیقت، گیاهان حساس، از آسیب ناگهانی و برگشت ناپذیر سلول­هایشان که منجر به آسیب در غشای آنها می­شود در امان نیستند (ویراداسیلوا و همکاران، 1974). غشاها هدف اصلی فرآیندهای تخریبی القا شده با خشکی هستند و مشخص شده است که تحت تنش کمبود آب محتوای لیپید غشا کاهش پیدا می­کند (فامتی و همکاران، 1985؛ مونتیرو و دپائولو، 1990)، که این امر در ارتباط با ممانعت از بیوسنتز لیپید (فامتی و همکاران، 1987؛ مونتیرو و دپائولو، 1993) و تحرک لیپولیتیک و فعالیت­های پروکسیداتیو است (فراری-ایلیو و همکاران، 1994؛ ساح ساح و همکارن، 1998؛ ایل­معروف و همکاران، 1999؛ ماتوس و همکاران، 2001). اگر چه اطلاعاتی از تجمع ترکیبات لیپیدی مختلف در غشای سلولی برگ­های آرابیدوپسیس در پاسخ به تنش خشکی در دست نیست (لئون و همکاران، 1994؛ ایل­معروف و همکاران، 1999). ولی مطالعات انجام شده نشان می­دهد که در برگ­های گیاهان آرابیدوپسیس که تحت سطوح مختلفی از پس­آبیدگی (خفیف تا خیلی شدید) قرار داشتند اسیدهای چرب قطبی و فعالیت­های لیپولیتیک تغییر پیدا می­کند. تغییرات قابل توجه در ترکیبات لیپیدی، افزایش در اسیدهای چرب غیر اشباع و تغییر در تعادل بین دو نوع گالاکتولیپید، به نام مونوگالاکتوزیل­دی­اسیل گلیسرول (MGDG) و دی­گالاکتوزیل-دی­اسیل گلیسرول (DGDG) است (گیگون و همکاران، 2004).

متابولیسم فسفولیپید­ها در پاسخ گیاهان به تنش خشکی و تنش شوری درگیر هستند. کاتاگیری و همکاران (2001) نشان دادند که فسفولیپاز D(PLD) و محصول فسفاتیدیک اسید در علامتدهی تنش­ها نقش دارند، آنها، cDNA فسفولیپاز D را که پروتئین ATPLDS را کد می­کند را از بین کتابخانه cDNA حاصل از آرابیدوپسیس تالیاناهای پسابیده جدا کردند. پروتئین ATPLDδ حاوی 868 آمینواسید، یک دومین کاتالیتیک و یک دومین درگیر در اتصال یون کلسیم (ca²⁺) یا فسفولیپید می­باشد.

mRNA پروتئین ATPLDS در پاسخ به تنش پس­آبیدگی و تنش شوری تجمع پیدا می­کند. آزمایشات هیستوشیمیایی نشان داده که بیان ژن ATPLDδ در بافت­های آوندی کتیلدون­ها و برگ­های تحت تنش پسابیدگی قویا افزایش پیدا می­کند.ولی در شرایط نرمال ژن ATPLDδدر ریشه­ها، برگ­ها، ساقه­ها و گل­ها بیان شده اما در غلاف­ها وجود ندارد. متابولیسم فسفولیپیدها نقش مهمی در انواع مختلفی از مسیرهای ترارسانی علامت گیاهان عالی و حیوانات دارند.

 در حیوانات، نوع خاصی از فسفواینوزیتید به نام فسفولیپاز C (PI-PLC) نقش کلیدی در انتقال پیام از G-پروتئین و گیرنده­های متصل به تیروزین کیناز در طول رشد و تقسیم سلولی دارند (مونیک و همکاران، 1995؛ پاپان و وانگ، 1999) همچنین کاتاگیری و همکاران (2001) نشان دادند که cDNA جدا شده از آرابیدوپسیس، آنزیم­های دخیل در متابولیسم فسفولیپید از جمله PLC، دی اسیل گلیسرول کیناز (DGK) و PIP5K (هیرایاما و همکاران، 1995؛ کاتاگیری و همکاران، 1996؛ میکامی و همکاران، 1998) را کد می­کنند و ژن­های آرابیدوپسیس برای PLC (Atplc1s) و PIP5K(Atpip5k1) تحت تنش خشکی از قبیل پس­آبیدگی یا تیمار شوری بالا و تیمار با آبسیزیک اسید (ABA) القا می­شوند. که حاکی از این است که واژگردی PI دخیل در مسیر ترارسانی علامت پاسخ­های تنش اسمزی است.

پاسخ گیاهان به تنش خشکی وابسته به تغییر در متابولیسم لیپید آنها است که این تغییرات بسته به نوع گیاه و شرایط خشکیدگی متفاوت است. (لیل­جنبرگ، 1992). عموما زمانی که لیپیدهای خنثی افزایش می­یابد میزان گلیسرولیپیدها و فسفوگلیسیریدها کاهش پیدا می­کند (می­یر و همکاران، 1992؛ استوانوویچ و همکاران، 1992؛ داخما و همکاران، 1995؛ اولسون وهمکاران، 1996؛ رپلین و همکاران، 1997؛ لائورییانو وهمکاران، 2000). مطابق با این، نشاندار کردن لیپیدهای موجود در غشا با مواد رادیواکتیو (ایزوتوپ ¹⁴c) نشان می­دهد که در اثر تنش خشکی میزان لیپیدهای غشا کاهش و میزان لیپیدهای خنثی افزایش پیدا می­کند (فام­تی و همکاران، 1985). همچنین میزان اسیدهای چرب غیر اشباع کاهش پیدا می­کند ( فام­تی و همکاران، 1987). تنش خشکی نه تنها موجب تغییر در بیوسنتز لیپیدها بلکه موجب تغییر در تجزیه و تخریب لیپیدهای قطبی نیز می­شود (ساح ساح و همکاران، 1998). تجمع معنی­دار فسفولیپاز D و گالاکتولیپاز بویژه در گونه­های حساس و افزایش بیان ژن کد کننده فسفولیپاز D در گیاهان گاودانه حساس به تنش خشکی دیده شده ولی در کلتیوارهای مقاوم مشاهده نشده است (ایل­معروف وهمکاران، 1999). بیشتر، فعالیت و بیان ژن­های لیپوکسی ژناز سویا ( که می­تواند مولکول­های علامت­دهی لیپید را افزایش دهند) تحت تنش خشکیافزایش پیدا کرده است (ماکارون و همکاران، 1995). ماتوس و همکاران (2001) نشان دادند که اسیل هیدرولاز القا شده تحت تنش خشکی در برگ­های گاودانه ممکن است در تخریب گالاکتولیپید ذکر شده در بالا دخیل باشد.

 

نقش اتیلن در ترارسانی

تنش معمولا موجب افزایش تولید اتیلن می­شود، اگر چه این همبستگی به خوبی مشخص شده است ولی روشن شده که بسیاری از مسیرهای بیوسنتز و فعالیت اتیلن می­تواند توسط تنش جایگزین شود (ایکر، 1995؛ فلورو ماتو، 1996؛ کند، 1993؛ یانگ و هافمن، 1984؛ زارمبینسکی و تئولوژیس، 1994). مواردی وجود دارد که سنتز اتیلن تحت تاثیر تنش تغییر نمی­کند، برای مثال، در علف­هرز آبزی (PotamogetonpectinatusL.) افزایش غیر معنی­دار اتیلن حاکی از آن است که تولید اتیلن تحت تنش (زخمی شدن، غرق آبی، هیپوکسی یا افزایش co₂) القا نشده بلکه تجمع 1-آمینو سیکلو پروپان 1-کربوکسیلات (ACC) موجب افزایش اتیلن تحت تنش­ها می­شود (سامرز و همکاران، 1996).

در رابطه با درک اتیلن و ترارسانی علامت آن در پاسخ به تنش­ها موثرترین روش جهت شروع فعالیت­های هورمون، اتصال گیرنده به هورمون و بعدا ترارسانی پیام­های تولیدی در پائین دست که هنوز به عنوان علامت یا پاسخ ایجاد می­شوند. برای یک تنش دو نوع ادراک درگیر است، ابتدا، گیاهان باید تنش را تشخیص داده و مقدار و شدت آن را تعیین کنند. بعدا تنش دریافت و پیام ترارسانی شده و تولید اتیلن افزایش پیدا می­کند، اتیلن باید درک و علامت­دهی شود تا منجر به علائم قابل مشاهده در گیاهان شود().

عوامل پاسخ به اتیلن (ERFs) در گیاه آرابیدوپسیس و توتون همسانه شده و القای آنها توسط اتیلن به اثبات رسیده است (سولانو و همکاران، 1998). فوجیموتو و همکاران (2000) مجموعه­ای از عوامل رونویسی (ATERF1-5) در گیاه آرابیدوپسیس را که از طریق اتصال ERE به جعبه Gcc، در تنظیم بیان ژنها نقش دارند شناسایی و همسانه­سازی کزدند. مطالعات بعدی نشان داد ژن ATERF4 توسط تنش­های پس­آبیدگی (سرما، شوری و خشکی) القا شده در حالیکه ATERE3 در تنش ملایم خشکی و شوری القا شده و ظاهرا در فرآیندی مستقل از ABA و اتیلن عمل می­کند.

تظاهر ژن­های خانواده ATERF در پاسخ به تنش­های غیر زیستی از جمله زخمی شدن، سرما، شوری بالا و خشکی از طریق مسیرهای وابسته و مستقل از اتیلن کنترل می­شود (فوجیموتو و همکاران، 2000).

پاسخ های  مولکولی گیاهان به تنش خشکی در سطح مولکولی و نقش ژن­ها و پروتئین­ها در افزایش مقاومت به تنش

در گیاهان و در همه بافت­های آنها پاسخ به تنش خشکی از طریق فرآیندهای مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و تغییرات متابولیکی رخ می­دهد. پاسخ گیاهان به تنش خشکی در سطح سلولی ممکن است ناشی از آسیب سلولی و در حالی که پاسخ­های دیگر ممکن است متناظر با فرایندهای سازگار شده باشد. اگر چه، تعداد زیادی از ژن­های القا شده با تنش خشکی در تعداد زیادی از گونه­های گیاهی مشخص شده، ولی اساس مولکولی مقاومت گیاهان به تنش کمبود آب کاملا مشخص شده است (اینگرام و بارتلز، ). مثلا جایگزینی ناگهانی  () در ریشه­ها از طریق  آوندآبکش و افزایش غلظت () در بافت­ها منجر به تغییرات فیزیولوژیکی عظیمی در پاسخ گیاهان به تنش خشکی می­شود (زوارت و کریلمن، 1998). تنش خشکی منجر به القای رنجی از پاسخ­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاهان می­شود. این پاسخ­های القا شده موجب بسته شدن روزنه­ها، کاهش رشد سلول و فتوسنتز، و افزایش تنفس سلولی می­شود. تحت تاثیر تنش خشکی ژن­هایی با کنش متفاوت القا یا سرکوب می­شوند (شینوزاکی و یاماگوچی شینوزاکی). تولیدات بیشتر این ژن­ها ممکن است در پاسخ و همچنین مقاومت در سطح سلولی نقش داشته باشند. مشخصا، معرفی بسیاری از ژن­های القا شده با تنش از طریق فرآیندهای انتقال ژن منجر به افزایش مقاومت گیاهان به تنش می­شود (زانگ و همکاران، 2004؛ امزاوا و همکاران، 2006). اخیرا، بسیاری از ژن­های القا شده با تنش با استفاده از بررسی­های ریزآرایه­ای در گونه­های مختلف گیاهی مشخص شده­اند و در حال حاضر،تجزیه و تحلیل کنش این ژنها به عنوان معیاری برای درک بیشتر و بهتر مکانیسم­های مولکولی گیاهان عالی در پاسخ و مقاومت به تنش، و در نهایت منجر به افزایش مقاومت به تنش در محصولات زراعی ترانسژنیک برای تنش می-شوند.

 

حفاظت ساختارهای سلولی:

یک گروه بزرگ از ژن­هایی که توسط تنش تنظیم می­شوند با آزمایش جنین­هایی که در خلال رسیدگی دانه به صورت طبیعی خشک می­شوند، کشف شده است. این ژن­ها پروتئین­های معروف به پروتین­های LEA (پروتئین­های فراوان در مراحل پایانی جنین زایی) را رمزسازی می کنند و انتظار می رود که در محافظت از غشای سلول ایفای نقش نمایند. اگر چه نقش پروتئین­های LEA به روشنی مشخص نشده است ولی آنها در طول مرحله تنش اسمزی در بافت­های رویشی انباشته می­شوند. پروتئین­هایی که توسط این ژن­ها رمزسازی می­شوند آبدوست هستند و قویا به آب متصل می­شوند. نقش محافظتی آنها می­تواند به دلیل توانایی آنها در حفظ آب و جلوگیری از کریستاله شدن پروتئین­ها و سایر مولکول­های مهم در خلال خشک شدگی باشد. این امر حتی می­تواند یکی از عوامل پایداری غشا باشد.برخی از فرآورده­های ژن­های القا شده تحت تنش کمبود آب در حفاظت ساختارهای سلولی نقش دارند. این پروتئین­ها که عموما LEA نامیده می­شوند، یک گروه اصلی از پروتئین­هایی هستند که به طور عادی در مراحل پایانی جنین­زایی و یا در پاسخ به پس­آبیدگی، دمای پایین، شوری یا تیمار آبسیزیک اسید (ABA) اگزوژن تجمع پیدا می­کنند که نشان دهنده پاسخ آنها به پس­آبیدگی سلولی است. پروتئین­های LEA بیشتر در بین گونه­های تک لپه و دو لپه­ای و در بسیاری از اشکال مولکولی جداسازی شده توزیع شده­اند. پروتئین­های LEA بر پایه ترکیبات آمینواسیدی، آبدوستی و حلالیت بالای آنها در آب و اغلب توسط حلالیت آنها پس از ساخته شدن مشخص می­شوند. هومولوژی در بین پروتئین­های LEA مختلف شامل وجود دومین­های پروتئینی حفاظت شده، حضور بموقع آنها و توسعه بیان ژن­های خاصی از آنها است که دلایل اساسی نقش آنها در مقاومت به پس­آبیدگی است. گفته می­شودکه این پروتئین­ها در حفاظت از ساختار سیتوپلاسم سلول­ها در طی تنش کمبود آب نقش دارند.

پروتئین­های LEA براساس خواص بیوشیمیایی مشخص و موتیف­هایی با توالی­های مشخص به 6 گروه تقسیم می­شوند (دیور و همکاران، 1989؛ اینگرام وبارتلر، 1996؛ کامینگ، 1999).

پروتئین­های گروه دوم LEA

این گروه از پروتئین­ها را دهایدرین نیز می­نامند (کلوز و همکاران، 1989). که بیشتر در گیاهان و از جمله جلبک­ها یافت می­شوند (سکاردی و همکاران، 1994؛ کلوز، 1996؛ لیس و همکاران، 1996).

دهایدرین­ها پروتئین­هایی هستند که بهترین و بیشترین مطالعات برروی آنها صورت گرفته است. دهایدرین­ها براساس یک موتیف 15-آمینواسیدی غنی از لیزین مشخص شده­اند (K-Segment, EKKGIMDKIKGKLPG)، و پیش بینی می­شود که از یک مارپیچ آلفای آمفی پاتیک، یک قطعه متصل به باقیمانده سرین و یک موتیف حفاظت شده که حاوی توالی DGYGNP در بخش Nترمینال خود است، تشکیل شده است.

اگر چه نقش فیزیولوژیکی باقی مانده­های فسفریله شده هنوز مشخص نشده ولی در بیشتر دهایدرینها یک خوشه سرین که توانایی فسفریله شدن را داراست، یافت شده است (کلوزه و همکاران، 1993). گفته می­شود که یکی از نقش­های پروتئین­های گروه دوم LEA، حفاظت از غشا و ساختارهای پروتئینی تحت پس­آبیدگی است (دیوره، 1993؛ کازوکا و اوادا، 1994). استفاده از دهایدرین­ها در غشای پلاسمایی (دئوره، 1993) و غشای داخلی (دئوره، 1993) نقشی مشابه با نقش قبلی آنها از خود نشان داده­اند (کازوکا و اووادا، 1994).

در گوجه فرنگی، گندم و جو پروتئین های LEA موجب افزایش مقاومت به تنش­های اسمزی و سرمایی می­شوند (زانگ و همکاران، 2000) و در جو، برنج ترانسژنیک (زو وهمکاران، 1996) و گندم (سیوامانی، 2000) پروتئین­های LEA موجب افزایش مقاومت به تنش کمبود آب می­شود.

در یک نوع جلبک و بیشتر در شرایط آزمایشگاهی پروتئین LEA موجب حفظ آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) از خطرات تنش سرمایی می­شود.

پروتئین­های گروه سوم LEA

گروه سوم از پروتئین­های LEA براساس داشتن یک موتیف 11 آمینواسیدی تکراری مشخص شده­اند هارادا و همکاران (1989) گزارش کرده­اند که این موتیف 11 آمینواسیدی بیش از 13 بار در پروتئین 76Lea کلزا تکرار شده است. دیور و همکاران (1989) پیش بینی کردند که اشکال پپتیدی 11 آمینواسیدی مارپیچ آلفای آمفی­پاتیک، احتمالا واکنش­های داخل مولکولی و بین مولکولی را دارند.

در گیاهچه­های گندم به شدت پس­آبیده شده، تجمع بالای پروتئین­های گروه سوم LEA منجر به مقاومت بافت به پس­آبیدگی می­شود (ریدووالکر-سیمونز، 1993). مطالعه بر روی چند واریته از برنج­های ایندیکا (L.Oryzasativa) نشان می­دهد که میزان پروتئین­های گروه دوم LEA و گروه سوم LEA در ریشه­های القا شده بوسیلهABA و شوری افزایش می­یابد و این افزایش در واریته­های مقاوم در مقایسه با واریته­های حساس دیده می­شود(مونز و همکاران، 1995).

پروتئین­های گروه سوم LEA درجو که HVA₁ نامیده می­شوند. ابتدا در لایه آلرون مشخص شده است. بیان ویژه ژن HVA₁ در لایه آلرون و جنین در مراحل پایانی توسعه بذر در ارتباط با مرحله خشکی بذر است (هونگ و همکاران، 1988). بیان ناگهانی ژن­های HVA₁ درگیاهچه­های جوان توسط ABA و شرایط تنشی از جمله پس­آبیدگی، شوری و دمای بالا القا می­شود (هونگ و همکاران، 1992). ژن HVA₁ جو و ژن PMA2005 گندم (کیوری و همکاران،1991؛ کیوری و والکر-سیمونز، 1993) تشابه بالایی در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی دارند. ژن HVA₁ دارای یک قطعه تکراری آمینواسیدی مشابه با گندم با سه تکرار می­باشد( کیوری و همکاران، 1991). این دو ژن تک لپه (HVA₁و PMA2005) وابستگی تنگاتنگی با ژن D-7 کتان (بیکر و همکاران، 1988) و ژن D_C3 هویج (سفنز و همکاران، 1990) دارند که با ساختمان ژنی مشابهی مشخص شده است (استراب و همکاران، 1994).

یک گروه26KDاز پروتئین­های گروه سوم LEAتنها در برنج­های واریته ایندیکای مقاوم به شوری تحت تاثیر ABA و تنش شوری القا شده بودند (مونز و همکاران، 1995). بر اساس توالی­های پپتیدی پروتئین­های LEA برنج، پروتئین­های LEA برنج بیش از 72% شباهت با پروتئین­های گروه سوم LEAجو (هونگ وهمکاران، 1988) و گندم (کیوری و همکاران، 1999) نشان می­دهند. همچنین پروتئین­های گروه سوم LEA در برنج، گندم و جو تحرک الکتروفورزی مشابهی دارند. یکی از نقش­های پروتئین­های گروه سوم LEA حذف یون­هایی است که در طی پس­آبیدگی سلولی تجمع پیدا کرده­اند، می­باشد (دئوره، a1993).

 

حسگرها و تنظیم اسمزی

" سیستم دو جزئی" در همه جا منتشر و در انواع مختلفی از مسیرهای ترارسانی باکتریها درگیر است. در باکتری اشریشیاکولای (E. coli) یک سیستم دو جزئی جهت احساس تغییر اسمزی و پاسخ­های اسمزی نقش دارد. Envz یک هیستیدین کیناز دو جزئی است که نقشی مشابه یک حسگر اسمزی یا یک حسگر کینازی دارد و تغییرات مکانیکی غشای پلاسمایی را در طول تنش اسمزی بررسی می­کند. (ورگلر- مورفی و سیتو، 1997) پروتئین حسگرEnvz توسط خود فسفریلاسیون باقی­مانده هیستیدین تحت شرایط اسمزی بالا، فعال شده و سپس باقی­مانده آسپارتات پروتئین ompR را در یک پاسخ تنظیمی فسفریله می­کند. نقشompRفسفریله شده به عنوان یک عامل رونویسی بیان ژن ompRرا تحریک و از بیان ژنompFممانعت می­کند. هر دو ژن پروتئین­های باکتریایی غشای بیرونی را کد می­کنند و مجموعه این پروتئین ها در تنظیم فشار تورگر نقش دارند.

در مخمر، اسمولاریته بالا موجب فعال شدن یک آبشارMAPKای از جمله PBS₂(MAPKK) و HOG1 (MAPK)، و سپس فعال شدن چندین ژن درگیر در بیوسنتز گلیسرول، که یکی از مهمترین مواد نگهداری کننده اسمزی است، می­شود. پروداکت سه ژن (Sln1p, Ypd1p, Ssk1p) که در اولین فاز پاسخ به تنش اسمولاریته بالا نقش دارند، مولکول­های علامت­دهی را کد می­کنند که یک سیستم تنظیمی دو جزئی از نوع پروکاریوتی را بوجود می­آورند. (پوساس و همکاران، 1996 ؛ ورگلر _ مورفی و سیتو، 1997).

ژنSln1pاز طریق کمک به یک پروتئین حسگر، پروتئین­های تنظیم کننده پاسخ Ypd1p و Ssk1p را تحت شرایط اسمولاریته بالا فسفریله می­کند. این سه فاکتور پروتئینی در طی چهار مرحله فسفریله می­شوند. ( هیستیدین -آسپارتات -هیستیدین – آسپارتات). در اسمولایته بالا پروتئینSsk1p فسفریله شده و موجب فعال شدنSskzpیا Ssk22p (MAPKKKs؛ مدا و همکاران، 1995) که منجر به فعال شدن Pbs2p(MAPKK) از طریق فسفریلاسیون انتهای سرین-ترئونین می­شود. Pbs2p پس از فسفریله شدن موجب فعال شدن Hog1p(MAPK) توسط فسفریلاسیون انتهای سرین –ترئونینمی­شود. یک مکانیسم حس کننده اسمزی مشابه ممکن است در گیاهان عالی و در پاسخ به کمبود آب مشاهده شود. احتمالا یکی از هیستیدین کینازهای دو جزئی به عنوان حسگر اسمزی در پاسخ به تنش خشکی در گیاهان عالی نقش دارد زیرا هومولوگSLN1در آرابیدوپسیس، ATHK1، اخیرا در موتانت­های sln1مخمر نشان داده شده و به عنوان یک حسگر اسمزی در مخمر نقش دارد ( یورائو و همکاران در شکل 3 ). در گیاهان عالی ETR1، یکی دیگر از هیستیدین کیناز دو جزئی است که نقش گیرنده را در ترارسانی علامت اتیلن به عهده دارد. (چانگ، 1996) هیستیدین کینازهای دو جزئی ممکن است نقش حسگر یا گیرنده را در مسیرهای مختلف ترارسانی علامت در گیاهان داشته باشند.

از دیگر حسگرهای اسمزی غشای پلاسمایی Sho1pاست که توسط مدا و همکاران در سال 1995 گزارش شده است. Sho1pشامل چهار بسته پپتیدی هیدروفوبیک محرک در غشا است. که در ناحیه Cترمینال حاوی یک دومین SH₃است که مسیرهای ترارسانی علامت مختلفی را تنظیم می­کند. تحت شرایط اسمولاریته بالاSho1pموجب فعال شدن PBS₂-HOG1آبشار MAPKایمی­شود. پروتئین غشائیمشابه Sho1pممکن است به عنوان یکی دیگر از حسگرهای اسمزی در گیاهان ایفای نقش کنند (شکل 3).

 

تنظیم اسمزی

حفظ فشار تورگر از طریق افزایش متوسط، در غلظت مواد محلول سلول را تنظیم اسمزی می­گویند و احتمالا مهمترین مکانیسم در حفظ فعالیتهای فیزیولوژیکی از جمله پتانسیل آب (_Wψ) برگها است(مورگان، 1984؛ اوبر و همکاران، 2005).

تنظیم اسمزی موجب مقاومت گیاهان زراعی از جمله آفتابگردان به تنش خشکی می­شود(چیمنتی و همکاران، 2002).رنج زیاد تنطیم اسمزی و نقش آن در حفظ عملکرد تحتتنش خشکی در ژنوتیپ­های آفتابگردان مشاهده شده است(چیمنتی و همکاران، 2002).

در بسیاری از گیاهان حفظ تورژسانس توسط تنظیم اسمزی موجب بهبود عملکرد و زنده­مانی آنها در شرایط تنش خشکی می­شود(مک کوی، 1986).همچنین حفظ فشار تورگر از طریق تغییر در خواص دیواره سلولی امکان­پذیر است و در شرایط کمبود آب ژنوتیپ­هایی از گندم که دارای تنظیم اسمزی بالاتری نسبت به ژنوتیپ­های دیگر دارند دارای عملکرد بالایی بوده­اند(مورگان و همکاران، 1986).بعلاوه تنظیم اسمزی موجب افزیش شاخص برداشت از طریق انتقال اسیمیلاتها به بذر و حذف برگ­های پیر می­شود (تورنس، 1997).

رابطه بین تنظیم اسمزی و عملکرد دانه تحت شرایط تنش خشکی در گندم (مورگان و همکاران، 1986؛ مورگان، 1995؛ مصطفی و همکاران، 1996)، سورگوم ( سانتامریا و همکاران، 1990) ، نخود (مورگان و همکاران، 1991) و نخود فرنگی (ماریبونا و همکاران، 1992) گزارش شده است.

وتبرگ و شارپ (1991) گزارش کردندکه تنظیم اسمزی یکی از فاکتورهای مهم برای افزایش طول ریشه در خاک­های خشک است.

پرولین و تنظیم اسمزی:

پاسخ­های مولکولی گیاهان به انواع مختلفی از تنش­های غیر زیستی اهمیت بالایی داشته و این نوید را می­دهد که تغییرات ژنتیکی محصولات زراعی برای فایق آمدن بر این تنش­ها راه­های بهتری را به نمایش خواهد گذاشت. این­ها مکانیسم­های مولکولی هستند که بوسیله اصلاح یا بهبود ارگانیسم­ها در اثر تنش­های محیطی، برای مثال تجمع سازگار اسمولیت­ها از قبیل پرولین پدید آمده­اند.یکی از ترکیبات مورد مطالعه در حفظ پتانسیل اسمزی اسید­آمینه پرولین می­باشد. تجمع آزاد پرولین در شرایط بالای اسمزی به مدت 45 سال مطالعه شده است.تجمع پرولین تحت تنش­های غیرزیستی به میزان چند میلی­مولار است که بسته به گونه گیاهی و میزان تنش متفاوت است (دلائونی و ورما، 1993؛ بونرت و جنسن، 1996).

تجمع بیش از حد پرولین در سلول­ها (بیش از 80% آمینو اسیدهای تحت تنش و 5% تحت شرایط نرمال) که منجر به افزایش سنتز و کاهش تخریب آن تحت تنش­های مختلفی از قبیل شوری و خشکی در بسیاری از گونه­های گیاهی می­شود (دلائونیو ورما، 1993؛ کول و همکاران، 1991). در آرابیدوپسیس پرولین 20% از اسیدهای آمینه آزاد تحت تنش کلرید سدیم را تشکیل می­دهد. اگر چه پرولین در مقاومت اسمزی در طول تنش­ها شناخته شده است ولی نقش اصلی آن در رشد گیاهان به طور کامل مشخص نشده است (کسونکا و هنسون، 1993؛ دلائونی و همکاران، 1993).

در سال­های اخیر، تلاش­های زیادی جهت افزایش میزان تجمع پرولین در گیاهان از طریق انتقال ژن­های وابسته به مسیر بیوسنتزی آن صورت گرفته است. مقاومت به تنش­های غیر زیستی، بویژه شوری و بهبود رشد گیاه در گونه­ای از گیاهان ترانسژنیک که برای تولید هر چه بیشتر پرولین مهندسی شده بودند، مشاهده شده است (کاویکیشور و همکاران، 1995؛ روسنز و همکاران،2002). به نظر می­رسد که پرولین نقش­های متفاوتی از قبیل پایداری پروتئین­ها، غشا و ساختارهای زیر سلولی و حفاظت از ساختارهایسلولی بوسیله احیای گونه­های فعال اکسیژنی یا ROSها تحت شرایط تنش اسمزی دارد (بونرت و شن، 1999).

پرولین در سیتوپلاسم و میتوکندری گیاهان از گلوتامات و بواسطه دلتاپیرولین-5-کربوکسیلات (P5C) ساخته می­شود. آنزیم­های کلیدی در فرآیند شکست و احیای گلوتامات، (P5C) سینتتاز (P5CS) و P5C ردوکتاز (P5CR) می­باشند (هر و همکاران، 1999). ژن­های رمز کننده این آنزیم­ها در گیاهان متعددی از جمله برنج (ایقاراشی و همکاران، 1997)، آرابیدوپسیس (ساووره و همکاران، 1995؛ ایستریزو و همکاران، 1997؛ فوجیتا و همکاران، 1998)، یونجه و گوجه فرنگی (ایستریزو و همکاران، 1997؛ فوجیتا و همکاران، 1998) همسانه شده­اند و آزمایشات نشان داده است که تظاهر آنزیم P5C در شرایط تنش­های اسمزی و خشکی افزایش بیان داشته و این افزایش بیان بواسطه ترارسانی و پیام­های وابسته به ABA و مستقل از ABA اتفاق می­افتد.

در گیاهان انتقال آمینواسیدها نه تنها توسط سیستم­های داخلی بلکه توسط پیام­های محیطی نیز صورت می­گیرد (وادیت و همکاران، 2002؛ لوپز و همکاران، 2000؛ فیشر و همکاران، 1998). مدارک موجود نشان می­دهد که پرولین Permeaseها ممکن است در غشای سلول واقع شوند. ذخیره پرولین اگزوژن در کالوس­های برنج تحت تنش اسمزی موجب افزایش در اندازه کالوس­ها در شرایط اینویترو می­شود (کاویکیشور، 1996). این آزمایش نشان می­دهد که انتقال دهنده­های پرولین در گیاهان وجود دارد. در گیاهان تمامی مسیرهای بیوسنتز پرولین به خوبی مشخص شده ولی جذب و انتقال آن به خوبی مشخص نشده است (دلائونی و ورما، 1993). گیروس و همکاران (1996) گزارش کردند که فرآیندهای انتقال پرولین نقش مهمی در سازگاری یونجه به تنش اسمزی دارند.

ایجاد گیاهان ترانسژنیک جهت افزایش تجمع پرولین در مقاومت به تنش خشکی برای اولین بار در گیاه توتون انجام شده است. این گیاهان با استفاده از ژن P5CS جدا شده از V.aconitifolia تحت پروموترS35ویروس موزائیک توتون ترانسفرم شده­اند. گیاهان ترانسژن مقدار بالای آنزیم و حدود 18- 10 برابر پرولین بیشتری نسبت به گیاهان شاهد تولید کردند. تولید بیش از حد پرولین موجب افزایش حجم ریشه و مقاومت گیاهان به تنش کلرید­سدیم در شرایط گلخانه­ای می­شود (کاویکیشورو همکاران، 1995).

گلایسین بتائین:

     قبل از این بسیاری از شاخص های بیوشیمیایی مشارکت کننده در تحمل به تنش­های غیرزیستی شناسایی شده بودند، ولی اخیرا آنتی اکسیدان­ها و محلول­های آلی نظیر گلایسین بتائین و پرولین بیشتر مورد توجه قرار گرفته­اند و گیاهانی که میزان این ترکیبات در سلول­های آنها بیشتر باشد نسبت به تنش­های غیرزیستی متحمل­تر گزارش شده­اند (اشرف و هاریس، 2004).

گلایسین بتائین یک ترکیب آمونیومی متیله شده است. این  مولکول در شرایط فیزیولوژیکی باری نداشته و قادر به ایجاد پایداری در ساختمان و فعالیت بسیاری از مولکول­ها است. اثرات حفاظتی گلایسین بتائین ناشی از برهم­کنش مستقیم با ماکرومولکول­ها و یا از طریق تشکیل نوعی حفاظ آبدار بدور ماکرومولکول­های پیچیده صورت می­گیرد. در نتیجه در ماکرومولکول مورد حفاظت وضعیت ترمودینامیکی مناسبی بوجود آمده است و آن را در مقابل تجزیه مقاوم می­کند (پاپاجورجیو و موراتا، 1995). فعالیت گلایسین بتائین در شرایط اینویو محدود به تنظیم اسمزی نمی­شود. آزمایشات متعدد در شرایط آزمایشگاهی نشان می­دهد که گلایسین بتائین به عنوان یک محافظت کننده اسمزی از طریق تثبیت ساختار پروتئین­ها و دیگر ساختارهای غشایی در مقابل اثرات مخرب شوری و دمای بالا است (گورهام، 1995). در سیستم­های فتوسنتزی، برای مثال، گلایسین بتائین القا شده تحت تنش شوری از اجزای مکانیسم فتوسنتزی از قبیل ریبولوز1-5بیس فسفات کربوکسیلاز/اکسیژناز و فتوسیستم IIاز طریق غیرفعال سازی و تکنیک­های مشابه از زیر واحدهای آنها حفاظت می­کند (پاپاجورجیو و موراتا، 1995). اثرات مثبت گلایسین بتائین در شرایط اینویترو، وجود رابطه مثبت بین تجمع بتائین و مقاومت به تنش­های شوری و سرما به ترتیب در ذرت و جو است (رودز و همکاران، 1989). مطالعات اخیر، از درک نقش­های احتمالی گلایسین بتائین در سلول­های تحت تنش، حاکی از این است که بتائین موجب عدم ثبات مارپیچ دوگانه DNAو کاهش دمای ذوب DNA در شرایط اینویترو می­شود. بنابراین بتائین ممکن است در افزایش رونویسی و تکرار DNAتحت شرایط تنش شوری بالا نقش داشته باشد (راجندراکومار و همکاران، 1997).گلایسین بتائین بهمقدارزيادیدركلروپلاستوجوددارد،درجایی كهميتواندنقشمهمیدرتنظيموحفاظت غشايتيلاكوئيديداشتهباشدتادرنهايتباعثحفظكاراييفتوسنتزيشود(روبینسونو جونز،  1986؛جناردو همکاران،1991).

امروزه اثر حفاظت کنندگی گلایسین بتائین در گیاهان عالی در برابر تنش شوری- اسمزی مشخص شده است. این ترکیب علاوه بر تنظیم اسمزی (اشرف و فولاد، 2007) با پایدار نگهداشتن فعالیت واحدهای زیادی مانند استنتاج اکسیژن[4] فتوسیستم II (هاریناسوت و همکاران، 1996)، غشاها، ساختمان چهارم پروتئین­ها (موراتا و همکاران، 1992) و آنزیم روبیسکو می­تواند اثرات تنش­ها را کاهش دهد.

ساکاماتو و موراتا (2002) گزارش کردند که گیاهان مختلف ظرفیت بیوسنتز گلایسین بتائین متفاوتی دارند. بعضی گیاهان مانند اسفناج و جو مقدار گلایسین بتائین بالایی را در کلروپلاست خود دارند در حالی که گیاهانی مانند آرابیدوپسیس و توتون این ماده را سنتز نمی­کنند.

شواهد ژنتیکی بدست آمده از ذرت (رودس و همکاران، 1989) و جو (گرومت و هانسون، 1986) نشان می­دهد که افزایش GB در اثر بروز تنش ناشی از کلرید سدیم، تحمل به شوری را بهبود می­بخشد.

همچنین امروزه اثر آنتی اکسیدان  GBدر بسیاری از گیاهان مانند گندم (رضا و همکاران، 2007)، برنج (فروق و همکاران، 2008)، چای (کومار و یاداو، 2009) و mung bean (حسین و فوجیتاو، 2010) به اثبات رسیده است. رودس و همکاران (1989) گزارش کردند که سطوح مختلف GBدر گونه­های Poaceae با میزان تحمل به شوری در ارتباط هستند.

گلایسین بتائین در بستره کلروپلاست (استروما) و طی یک اکسیداسیون دو مرحله­ای کولین به بتائین آلدئید و تبدیل بتائین آلدئید به گلایسین بتائین ساخته می­شود. این دو مرحله توسط دو آنزیم کولین مونواکسیژناز (CMO) و آلدئید دهیدروژناز (BADH) کاتالیز می­شود (مک نیل و همکاران، 1999).

 

سیستم­های دفاعی آنتی اکسیداتیو در گیاهان و نقش آنها در مقاومت به تنش خشکی

هنگامی که تنش برای گیاه اتفاق می­افتد، بسته شدن روزنه­ها در اثر تنش موجب کاهش غلظت CO₂ در بافت مزوفیل برگ شده و فعالیت­های فتوسنتزی گیاه به اندازه­ای نیست که قادر به جذب همه انرژی نوری اکتسابی از خورشید باشد. در چنین شرایطی مولکول­های اکسیژن به عنوان گیرنده ثانوی الکترون عمل کرده و در نتیجه انواع مختلفی از اکسیژن فعال در سلول تولید می­گردد که به طور کلی AOS یا ROS نامیده می­شود.

سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن و بنیانهای هیدروکسیل از دسته مولکول­های اکسیژن فعال هستند که اثرات مخربی بر روی مولکولهای DNA، پروتئین­ها و چربی­های غشا دارند (چاوز و همکاران، 2003). گیاهان برای حفظ ساختارهای سلولی خود از آسیب­هایفوق از سیستم­های آنتی اکسیدانی مختلفی جهت تخریب مولکول­های AOS استفاده می­کند.

در گوجه فرنگی، در اثر تنش خشکی میزان Cu/Zn-SOD سیتوسولی افزایش چشمگیری داشته در حالی که Cu/Zn-SOD کلروپلاستی تحت تاثیر قرار نگرفته و ثابت باقی می­ماند. در اثر تنش خشکی فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز در گندم و کتان افزایش می­یابد (بورک و همکاران، 1985). که این آنزیم موجب حذف پراکسیدهیدروژن (H₂O₂) می­شود افزایش این آنزیم ممکن است موجب افزایش NADH در دسترس شده و از این طریق بتواند الکترون را از فرودوکسین جذب کرده و تشکیل سوپراکسید را به حداقل برساند. در گونه­هایی از جو مقاوم به خشکی، میزان گلوتاتیون ردوکتاز و آسکوربات پروکسیداز افزایش یافته، اما، فعالیت سوپر اکسید دیسمیوتاز(SOD) آزمایش نشده است. (اسمیرنوف و کلوب، 1998). مقاومت ایجاد شده در کتان تحت تنش خشکی، به پاراکووات (بورک و همکاران، 1985). ممکن است نشان از وجود مکانیسم­های عمومی حفاظت در برابر این تنش­ها باشد. تغییرات القا شده تحت تنش خشکی در پراکسیداسیون لیپید و فعالیت­های سوپراکسید دیسمیوتاز (SOD) و کاتالاز که در دو نوع خزه،Tortuloruralis (مقاوم به خشکی) و Cratoneuron filicinum سازگار شده است (دهیندسا و ماتو، 1991). در طول تنش خشکی خزه مقاوم به خشکی سطوح پایینی از پراکسیداسیون لیپید به همراه افزاش سطح هر دو آنزیم را نشان می­دهد. و رقمحساس کاملا بر عکس. متابولیسم گلوتاتیون بعدا در خزه مقاوم مطالعه شده و اکسیدگلوتاتیون عامل تشخیص بهتری برایتنش خشکی است (دهیندسا، 1990). بررسی­های انجام شده بر روی اینبرد لاین­های ذرت حساس و مقاوم به تنش خشکی توسط مالان و همکاران (1990) نشان از همبستگی Cu/Zn-SOD و فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز دارد. اگرچه سطوح بالای تنها یک آنزیم ظاهرا تاثیری در مقاومت به خشکی ندارد.

سایرام و همکاران (1997و1998) نشان دادند که وجود سیستم حفاظت از H₂O₂ بوسیله آسکوربات پروکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز و کاتالاز اهمیت بالایی در مقاومت به تنش اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی دارند. مقاومت به تنش کمبود آب وابسته به ژنوتیپ توسط پروکسیداسیون پائین لیپید و پایداری بالای غشا، کلروفیلII و محتوای کاراتینوئید، رابطه قوی با سیستم آنزیمی آنتی اکسیدانت (SOD, APO, GR,CAT) دارند.

 

 ژنها و پروتئین-هایکاندیدای مقاومت به تنش خشکی

یکی از اهداف اساسی ژنتیک مولکولی تشخیص، شناسایی و جداسازی ژن­های مسئول صفات مهم است که برای این امر مهم سه راهکار اساسی وجود دارد. روش­های کلاسیک از قبیل همسانه سازی موضعی (تنکسلی و همکاران، 1995) وجهش­زایی درجی (بتولد و همکاران، 1993)، به طور موفقیت آمیزی به منظور تشخیص ژن­های بزرگ اثر مورد استفاده قرار گرفته­اند. با این­حال این روش­ها به خصوص در مواردی مانند اندازه بزرگ ژنوم گیاه مورد نظر ویا عدم وجود ترانسپوزون­ها فاقد کارائی لازم می­باشند (فلیگر و همکاران، 2001).

هنگامی که فرضیات مربوط به شناسایی ژن­ها بر اساس وظایف بیولوژیکی آن­ها طرح می­گردد، راهکار ژن­های کاندید (CG) به عنوان روش سوم مطرح می­شود (بیرن و همکاران، 1996؛ دووین و همکاران، 1999). بر اساس این راهکار ژن­های کاندید ممکن است به صورت ساختاری و یا ژن­های دخیل در فرآیندهای تنظیمی گیاه باشند. از آنجاییکه اکثر صفات گیاهی مهم در کشاورزی از گروه صفات کمی بوده و ژن­های زیادی به همراه اثرات محیط در تظاهر این صفات مشارکت دارند، راهکار ژن­های کاندید بیشتر از دو روش اول با مکان­های صفات کمی (QTL) سازگاری دارد (فلیگر و همکاران، 2001).

تعدادی از ژن­های گزارش شده در پاسخ به کمبود آب  در گونه­های  مختلف و کنش بسیاری از پروتئین­های کد شده توسط آنها از طریق توالی­یابی پروتئین­های شناخته شده مشخص شده است. ژن­های القا شده در طول تنش خشکی نه تنها از طریق کنش بلکه از طریق متابولیک پروتئین­ها در تنظیم ژن­های دخیل در ترارسانی علامت در پاسخ به تنش خشکی اهمیت دارند(شکل 1). بنابراین، تولیدات این ژن­ها به 2 دسته زیر تقسیم می­شوند. گروه اول پروتئین­هایی هستند که در مقاومت به خشکی نقش عملکردی دارند که عبارتند از: پروتئین­های کانال آب که در حرکت آب از عرض غشا نقش دارند، آنزیم­های مورد نیاز در بیوسنتز حفاظت کننده­های اسمزی مختلف ( قندها، پرولین و گلایسین بتائین)، پروتئین­هایی که احتمالا در حفاظت ماکرومولکول­ها نقش دارند (پروتئین LEA، اسموتین­ها، پروتئین­های ممانعت کننده از یخ­زدگی، چاپرون ها و پروتئین­های متصل شونده به mRNAها)، پروتئازهای واژگردی پروتئین (پروتئازهای تیولی، پروتئازهای CLP و یوبیکوئیتین­ها)، آنزیم­های سم­زدایی (گلوتاتیون s-ترانسفراز، هیدرولاز اپوکسید کننده، کاتالاز، سوپر اکسی دیسمیوتاز و آسکوربات پروکسیداز). بعضی از ژن­های القا شده تحت تنش خشکی کد کننده  پروتئین­هایی هستند که یک نقش آنزیمی در سنتز پرولین دارند و بیان بیش از حد آنها در گیاهان ترانس­ژنیک منجر به ایجاد فنوتیپ­های مقاوم به خشکی در بین گیاهان شده است. این­ها نشان دهنده کنش واقعی تولیدات ژنی در مقاومت به تنش­ها است (کاویکیشور و همکاران، 1995). گروه دوم شامل فاکتورهای پروتئینی هستند که احتمالا در تنظیم ترارسانی علامت و بیان ژن­های پاسخ به تنش­ها نقش دارند. این ژن­ها عبارتند از: پروتئین کینازها، فاکتورهای رونویسی، PLC و پروتئین­های 3-3-14 می­باشند. امروزه مشخص شده است که پروتئین­های تنظیمی اهمیت بالایی برای درک هر چه بیشتر پاسخ گیاهان به تنش خشکی دارند (اینگرام و بارتلز، 1996).

 

پروتئومیکس رابط بین ژنومیکس، ژنتیک و فیزیولوژی

  اصطلاحپروتئوموپروتئوميكساولينبارويلكينزوهمكاراندردهه1990پیشنهاد شد (نقل از ویلکینز و همکاران، 1996). پروتئوميكس عبارت است از مطالعه پروتئوم یا کل محتوای پروتئینی ژنوم می­باشد. برعکس ژنوم که در همه سلول­های سوماتیک یک ارگانیسم به یک اندازه ضرورت دارد، پروتئوم یک ماهیت دینامیک است که در سلول­های متفاوت انواع متفاوتی دارد و با بیان فنوتیپی/ فیزیولوژیکی اطلاعات ژنوم تغییر می­کند. مهمترین مزیت مطاله بیان پروتئین به روش پروتئومیکس در مقایسه با مطالعه بیان ژن­های منفرد، توانایی این رهیافت در نمایش تغییرات همزمان در گروه­های کاربردی یا پروتئین است(جیانگ و همکاران، 2008). به علت توانایی بالای تکنیک پروتئومیکس در تعیین توالی نوکلئوتیدی و بر اساس پیشرفت­های بدست آمده در تشخیص پروتئین­های حساس و ناگهانی بوسیله طیف سنجی جرمی (MS)، دست آوردهای پروتئوم که یک دیدگاه جدیدی در بررسی کنش­های پیچیده گیاهان مدل و گونه های زراعی در سطوح مختلف باز می­کندسبب شده تا این تکنیک به ابزار قدرتمندی جهت مشخص کردن کنش گیاهان تبدیل شود (فارانسیسکو و همکاران، 2004).

به علت پیشرفت سریع تکنیک­های جدا سازی و تشخیص پروتئین­های استخراج شده توسط الکتروفورز دو بعدی و روش­های بررسی تفاوت­های پروتئوم در مقیاس بزرگ، پروتئومیکس به عنوان ضروری­ترین متولوژی در زمینه­های مختلف بیولوژی گیاهی تبدیل شده است. از این تکنیک می­توان جهت مطالعه اثرات پلیوتروپی موتانت­ها، بررسی پاسخ­های داده شده به هورمون­ها و تغییرات محیطی و تشخیص مسیرهای متابولیکی درگیر با استفاده از کنش پروتئین­های تحت تاثیر، استفاده کرد. در سطح ژنتیک مولکولی، پروتئومیکس می تواند جهت ترسیم نقشه ژن­های ترجمه شده و مکان کنترل کننده بیان آنها، و همچنین جهت تشخیص پروتئین­های مسئول در تعدادی از صفات فنوتیپی پیچیده بکار رود. پیوستگی بین بیان ژنها و متابولیسم­­های سلولی از یک طرف و نقشه­های ژنتیکی از طراف دیگر سبب شده تا پروتیومیکس به عنوان یکی از قدرت­مندترین ابزار برای ژنومیکس عملکردی باشد (زیوی و دودین، 2000).

انتظار بر این است که مطالعه پروتئوم شرح و تفسیر یک ممیزی قابل فهم از تمامی پروتئین­های بیان شده در زمان خاص، شرایط خاص و یک موجود زنده خاص را ارائه کند. روشهای پیشرفته جدیدی به منظور مطالعه و سنجش میزان RNA (ترانس کریپتومیکس) مثل ریزآرایه و نمایش افتراقی ابداع شده است (مارشال، 1998). این روش­ها فاقد بینش لازم در مورد کمیت و کیفیت فرآورده­های نهایی ژن­ها یعنی پروتئین هستند (زیوی و دودین، 2000). مقادیر پروتئین در سلول معمولا فاقد رابطه قوی با میزان mRNA می­باشد.که شاید ناشی از تفاوت زیاد در قسمتی از mRNA و واژگردی پروتئین باشد. بعلاوه، بسیاری از پروتئین­ها تحت تغییرات پس از ترجمه از قبیل حذف پپتید­های علامت، فسفوریلاسیون و گلیکوزیلاسیون، که نقش مهمی در فعالیت آنها و سازگاری اجزای زیر سلولی دارند قرار می­گیرند. بنابراین تنها مطالعه پروتئین­ها، اطلاعات مربوط به آنها را در مورد اندازه واقعی و فعالیت آنها در یک زمان مشخص و در بافت معین یا پاسخ به تیمار مشخص را فراهم می­کنند (زیوی و دودین، 2000).

از طرف دیگر مشخص کرن ژن­هایی که در بهبود محصولات زراعی برای محیط­های با کمبود آب نقش بسیار مهمی دارند وگستردگی ریزآرایه­های mRNA و تغییر در سطوح بیان آن­ها امکان مطالعه زیادی را فراهم می­کنند. مطالعات انجام شده بر روی گیاه آرابیدوبسیس تالیانا نشان داده که بیش از 30% از ترانسکریپتوم در مقابل تنش نقش داشته و حدود 1008 mRNA در اثر تنش خشکی افزایش بیان نشان می­دهد (کریپس و همکاران، 2002).

رهیافت­های جدیدتر دانش پروتئومیکس را توسعه داده است. از جمله این راه کارها می­توان به کارماتوگرافی مایع دو بعدی، برچسب­های ایزوتوپ، چیپ­های پروتئینی برای مطالعه اثرات متقابل بین پروتئین­ها و پروتئین­ها با سایر مولکول­ها و بازیافت پیچیده­های چند زیر واحدی با استفاده از الکتروفورز غیر تقلیب کننده اشاره کرد (تیلمنت و همکاران، 2002).

 

الکتروفورزدو بعدی

الکتروفورز دو بعدی(2DE) با گرادیان PH (IPGs) به همراه طیف سنجی جرمی (MS) یکی از مهمترین ابزار پروتئومیکس جهت شناسایی پروتئین­ها می­باشد. با وجود روش­های جایگزین یاتکنولوژی­های مکمل (از قبیل الکتروفورز چندبعدی، نشاندار کردن پایدار باایزوتوپ، ریزآرایه­های انتی بادی یا پروتئین) که اخیرا ظهور کرده­اند، 2DE تنها تکنیکی است که می­تواند به صورت متداول و روتین برای بیان کمی پروفایل­های مجموعه بزرگی از مخلوط پروتئینی از قبیل lysates تمام سلول بکار رود.

2DE توانایی جداسازی مخلوط­های پیچیده پروتئینی را بر اساس نقطه ایزوالکتریک (PI)،جرم مولکولی (M_r)، حلالیت و فراوانی نسبی دارد. بعلاوه، این­ها نقشه­ای از پروتئین­های دست نخورده را ارائه می­دهند که تغییرات پروتئین­ها را در سطح بیان، ایزوفرم­ها یا تغییرات پس از ترجمه نشان می­دهد.این روش­ها در مقابل روش­هایی که بر اساس کارماتوگرافی فاز مایع با طیف­سنجی جرمی جفتی، تجزیه و تحلیل پپتیدها را بر اساس اطلاعات جرم مولکولی و نقطه ایزوالکتریک انجام می­دهند چیزی پیش پا افتاده است و نشانمند کردن پایدار با ایزوتوپ برای بررسی­های کمی پروتئین­ها لازم است. امروزه تکنولوژی الکتروفورز دو بعدی به همراه IPGs (گرگ و همکاران، 2000)، بر محدودیت­های آمفولیت­های حامل الکتروفورز دو بعدی (افارل، 1975) غلبه کرده و با قابلیت تکثیر، بررسی، حلالیت و جداسازی بسیاری از پروتئین­های اسیدی یا بازی در ارتباط است. با افزایش pH ژل­های IPGs ما بین 12-5/2 سبب توانایی آن­ها در آنالیز بسیاری از پروتئین­هایآلکالین و قطعات متناظر با بانک­های اطلاعاتی شده است. در ژل­های IPGs وجود اورلپ یا تداخل بسیار باریک موجب افزایش وضوح (001/0 = ) و در ترکیب با روش­های تغلیظ یاPrefractionation، موجب تشخیص پروتئین­هایی در مقادیر بسیار کم می­شود.

در این روش، پروتئین­ها در بعد اول با انجام IEF روی نوارهای ژلی لوله­ای بر مبنای بار الکتریکی خود از هم جدا می­شوند و بعد از متعادل سازی، نوارها روی ژل SDS عمودی یا افقی قرار می­گیرند تا با انجام بعد دوم، پروتئین­ها بر مبنای وزن مولکولی از هم تفکیک گردند.

الکتروفورز دو بعدی تکنیکی است که می­توان آن را تقریبا برای هر نوع نمونه حاوی پروتئین، از جمله بافت یا سلول یوکاریوتی، اندام­ها، مایع­های زیستی (خصوصا پلاسما یا سرم، ادرار، مایع مغزی-نخاعی، بزاق، اشک، موکوس بینی، شیر، مایع آمنیوتی، مایع منی و سم مار)، موجودات پروکاریوتی (باکتری، انگل، قارچ)، دانه و گیاه به کار برد (فی و لارسن، 2001).

صرفنظر از نوع نمونه، قبل از شروع الکتروفورز دو بعدی، باید نسبت به استخراج پروتئین­ها اقدام و آنرا برای انجام ایزوالکتریک فوکوسینگ آماده نمود (مرحله اول: آماده سازی نمونه). برای این منظور نیاز به افزودن ترکیباتی است که علاوه بر از بین بردن ساختار پروتئین و عدم تاثیر بر بار الکتریکی ذاتی آن، پروتئین را محلول نگه دارند. شکل..... مروری بر مراحل انجام الکتروفورز دو بعدی و به دنبال آن شناسائی نقاط بدست آمده روی ژل دو بعدیتوسط اسپکترومتری جرمی را نشان می­دهد. همانطور که در شکل دیده می­شود، پروتئین­های محلول شده بر روی یک شیب PH قرار گرفته و با اعمال اختلاف پتانسیل الکتریکی، در pH معادل نقطه ایزوالکتریک خود متمرکز می­شوند (مرحله دوم: متمرکز سازی ایزوالکتریکی پروتئین­ها یعنی IEF). سپس با احیا و به دنبال آن مسدود کردن پیوندهای دی سولفیدی و افزودن شوینده مناسبی که بار الکتریکی ذاتی پروتئین­ها را خنثی می­کند، پروتئین­ها آماده جداسازی بر روی بعد دوم می­شوند (مرحله سوم: متعادل سازی). با انتقال نوارها یا ژل­های بعد اول متعادل شده به روی ژل صفحه­ای پلی اکریل آمید دارای SDS، پروتئین­ها بر مبنای وزن مولکولی خود به طور نسبی از هم جدا می­شوند (مرحله چهارم: الکتروفورز روی ژل پلی اکریل آمید دارای SDS یعنی SDS-PAGE). در این مرحله باید پروتئین­ها را روی ژل دو بعدی آماده ظاهرسازی کرد که این عمل را می توان با رنگ­های عمومی نظیرآبی کوماسی و نیترات نقره رنگ­آمیزی و آشکار سازی کرد و یا از رنگ­های فلورسنت ، اتورادیوگرافی و یا رنگ­های اختصاصی که فقط پلی پپتیدهای خاصی را رنگ آمیزی می کنند استفاده نمود. حساسیت رنگ آمیزی با آبی کوماسی 50 تا100 برابر کمتر از نیترات نقره است، ولی نسبتاً آسان می باشد، ضمن اینکه برای آشکارسازی پروتئین­ها با آبی کوماسی پروتئین بسیار زیادی نیز لازم است. بنابراین در مواردی که مقدار پروتئین بر روی ژل کم باشد از رنگ آمیزی نیترات نقره استفاده می شود. با اینکه رنگامیزی با نیترات نقره حساسیت بالایی دارد اما روشی ایده آل برای بررسی کمی همه پروتئین­ها نیست. زیرا رابطه خطی بین مقدار پروتئین و میزان رنگ پذیری کم است و با افزایش غلظت پروتئین روی ژل از میزان این رابطه کاسته می شود (اونگ و پاندی[5]،2001 ). در رنگ آمیزی با آبی کوماسی نقطه­ها حداقل باید دارای 100 نانوگرم پروتئین باشند تا آشکار شوند. در حالیکه این مقدار در رنگ آمیزی نیترات نقره 2/0 نانوگرم است( نیو هوف و همکاران[6] ،1985 ). رنگ­های فلورسنت با طیف سنجی جرمی سازگارترند با اینکه میانگین حساسیت آن­ها اندکی از نیترات نقره کمتر است، اما از تکرار پذیری بالایی برخوردارند. بعلاوه این نوع رنگ­ها دارای دامنه فعال خطی گسترده تری از رابطه بین میزان رنگ و مقدار پروتئین هستند که این موضوع به دقت مقایسه،بین مقادیر پروتئین بر روی ژل های دو بعدی می افزاید. قیمت بالای این نوع رنگ­ها و تجهیزاتی که برای آشکارسازی آن­ها مورد نیاز است، از عوامل اصلی محدودیت کاربرد گسترده آن­ها در پروتئومیکس است (نیوهوف و همکاران ،1985؛یان و همکاران[7] ،2000) (مرحله پنجم: ظاهر سازی پروتئین­ها). بعد از اسکن کردن، نقاط ظاهر شده روی ژل دو بعدی مورد آنالیز با نرم افزارهای خاص قرار می­­گیرند و نقاطی که بیان آنها به طور معنی­داری بر اثر تیمار تغییر کرده انتخاب و برای تشخیص هویت آماده می­شوند (مرحله ششم: تجزیه و تحلیل کمی پروتئین ها).

محدودیت­های الکتروفورز دو بعدی:

اگر چه الکتروفورز دو بعدی به طور همزمان قادر است حدود 5000 پروتئین (به طور معمول حدود 2000 پروتئین) را از هم تفکیک کند که این خصوصیت وابسته به اندازه ژل و گرادیان pHاستفاده شده دارد. با استفاده از این تکنیک می­توان کمتر از یک نانو گرم پروتئین در هر نقطه از ژل را شناسائی کرد ولی تعداد واقعی پروتئین­ها خیلی بیشتر از این مقدار است. محدودیت­های الکتروفورز دو بعدی را می­توان در دو قسمت خلاصه کرد:

 

 

 

 

شکل ... شمای کلی الکتروفورز دو بعدی (پاندی و مان، 2000).

1- تنوع شیمیائی زیاد پروتئین­ها که می­تواند ناشی از دو خصوصیت ذاتی آن­ها باشد:

الف ) وسیع بودنمحدوده pI و وزن ملکولی  (MW) آن­ها:

ناهمگنی شیمیایی پروتئین‌هاکه مستقیماً به تنوع و نحوه عمل آنها ارتباط دارد، یکی از مشکلات اساسی پروتئومیکس است. به طور کلی نقطه ایزوالکتریک پروتئین‌ها در دامنه ای بین 3 الی 12 قرار گرفته و وزن مولکولی آنها نیز در دامنه ای بین 5 تا 200 کیلو دالتون قرار مي‌گیرد. این ناهمگنی زیاد یکی از چالش‌های اساسی جداسازی پروتئین‌ها براساس الکتروفورز دو بعدی به شمار مي‌رود (سالكده[8]،2002).محدوده pI و وزن ملکولی پروتئین ها حتی در ارگانیسم های ساده ،گسترده تر از محدوده ای است که به طور معمول بر روی ژل­های دو بعدی تجزیه می شود( واسینجروهمکاران[9] ،2000 ). پیشرفتهای اخیر در شیب های مختلف در دسترس pH می تواند حداقل تا حدی از این مشکلات را بر طرف کند (گورگ وهمکاران[10] ،1999؛ واسینجر و همکاران ،2000)و باعث بهبود پوشش کل پروتئوم یک سلول شود(تونلا و همکاران[11] ،2001 ).

ب ) متنوع بودن حلالیت پروتئین­ها :

مسأله سازترین مشکل در الکتروفورز دو بعدی مشکلات مرتبط با ا ستخراج پروتئین و محلول سازی آن­ها استکه خصوصا در ارتباط با پروتئین­هایی با حلالیت کم در آب از قبیل پروتئین­های غشائی و هسته­ای مطرح می­شوند (رابیلاد، 2002). تکنیک پروتئومیکس عمدتاً قادر به تفکیک و شناسایی پروتئین‌های آبدوست مي‌باشد که قابل حل در آب مي‌باشند. قسمت عمده ای از پروتئین‌های سیتوزول، ماتریکس میتوکندری و غشاهای سلولی که نقش مهمی در فرآیند های سلولی دارند از دسته آب گریز هستند که با روش­های معمولی شناسایی نمی شوند گرچه روش­های نوین استخراج و خالص سازی و نیز ترکیب کروماتوگرافی فاز مایع با طیف سنجی جرمی جفتی^[12] برای حل این مشکل ابداعشده­اند. با وجود مشکلات ذکر شده با توجه به کاربردها و مزایای پروتئومیکس استفاده از آن در دانش نوین بشری ضروری به نظر مي‌رسد. پروتئومیکس گیاهی نسبت به موجودات تک سلولی یوکاریوتی و پروکاریوتی علمی جوان بوده و در ابتدای راه خود قرار دارد. سهم عمده ای از این عقب ماندگی نسبی به کامل بودن توالی های ژنومی تک سلولی ها ارتباط دارد. اگرچه کامل شدن توالی گیاهانی مثل آرابیدوپسیس و برنج تا حدودی این مسئله را جبران کرده است، اما تعداد بالای پروتئین ها در این گیاهان از مشکلات عملی موجود به شمار می رود.

2- محدوده بیانی بسیار متنوع پروتئین­ها (رابیلاد، 2002): محدوده دینامیک 10⁶ یا 10⁵-1 در نمونه­های سلولی و 10⁹-1 در نمونه­های سرمی به­طور مشخص فراتر از محدوده الکتروفورز دو بعدی (حداکثر 10⁴) است (رابیلاد، 2002). محدوده بیانی بسیار متنوع پروتئین­ها آفت همه راهکارهای عمومی مربوط به جمعیت­هایپروتئینی است و این بدان معناست که راهکارهای تغلیظ یا perfractionation برای دستیابی به پروتئین­های با فراوانی پائین لازم است (رابیلارد، 2002).

علاوه بر این موارد ، مشکل اصلی دیگر در پروتئومیکس تجزیه داد­ه­ها می باشد. امروزه توانایی تولید اطلاعات از توانایی تجزیه داده­ها پیشی گرفته است(پترسون^[13]، 2003 ).

محاسن الکتروفورز دو بعدی

با وجود مشکلات الکتروفورز دو بعدی آن چه که باعث شده این تکنیک قدیمی هنوز مورد استفاده قرار بگیرد و هنوز تکنیک­های جدید تر نتوانسته­اند جایگزین آن شوند را به صورت زیر نام برد:

1- محتوای اطلاعات بدست آمده از الکتروفورز دو بعدی بالاست، زیرا می­تواند خواص تعدادی از پروتئین­های ویژه را تعیین کند. در این روش هزاران پروتئین می­تواند به طور همزمان تنها بر روی یک ژل الکتروفورز دو بعدی قابل تشخیص باشد، برای هر پروتئین، نقطه ایزوالکتریک ()ف جرم مولکولی و مقدار نسبی آن می­تواند اندازه­گیری شود. با استفاده از روش اسپکتروفتومتری جرمی، هر پروتئینی می­تواند از طریق روش انگشت­ نگاری جرمی پپتید و یا توال­یابی آمینو اسیدی مشخص شود.

2- قابلیت وضوح بالای الکتروفورز دو بعدی، که اجازه جداسازی  وتشخیص تغییرات پس از ترجمه پروتعین­ها را می­دهد. در بسیاری از فواصل، تغییرات پس از ترجمه پروتئین­ها می­تواند به اسانی در ژل­های الکتروفورز دو بعدی مکان یابی شود. زیرا، به نظر می­رسد که آنها به صورت نقاطی با خوشه­های افقی یا عمودی مشخص­ می­شوند. بعلاوه، تغییر پروتئین­ها می­تواند با استفاده از تجزیه و تحلیل­های اسپکتروفتومتری جرمی، در هنگامی که در چندین لکه پروتئینی، پروتئین­های مشابهی تشخیص داده شود، مشخص شود.

3- دارا بودن مراحل منحصر به فرد تجزیه و تحلیل پروتئوم (....، تصاویر، ...، بررسی پایگاه­های اطلاعاتی)، که می­تواند مستقل از زمان و مکان باشد. برای مثال، الکتروفورز دو بعدی و تجزیه و تحلیل کامپیوتری الگوی لکه­ها می­تواند توسط خود در آزمایشگاه انجام گیرد و یا این امکان وجود دارد که تجزیه و تحلیل لکه­های پروتئینی به زمان دیگری موکول شود. همچنین این­ها به این نکته اشاره می­کنند که ژل­های الکتروفورز دو بعدی توانایی بالایی در تجمع ذرات جهت خالص سازی و بایگانی دراز مدت پروتئین­ها را دارند. بر روی یک ژل الکتروفورز دو بعدی، هزاران پروتئین می­تواند در دمای اتاق و در فضایی کوچک نگهداری شود. 

 

 

کاربرد پروتئومیکس در مطالعهتنش­های محیطی در گیاهان :

ریکاردی و همکاران (1998) اولین مقاله در زمینه تغییرات پروتئینی پاسخ به تنش خشکی را در ذرت ارائه دادند گیاهچه­های دو لاین ذرت و هیبرید آنها در سه هفتگی به مدت 10 روز تحت تیمار خشکی قرار گرفتند. تغییرات پروتئین­های برگ توسط الکتروفورز دو بعدی بررسی شد. 78 پروتئین از 413 پروتئین کل دارای تفاوت معنی ­دار در شرایط نرمال و تنش بوده و از آن میان 38 پروتئین دارای الگوی بیان متفاوتی در دو لاین بودند.در بین پروتئین­های شناخته شده آنزیم­های درگیر در مسیرهای سوخت و ساز سلولی، چوبی شدن و نیز پروتئین­های پاسخ دهنده به ABA دیده شدند.

تجزیه و تحلیل پروتئوم برگ­های برنج (Oryza sativa L. cv CT9993, cv IR62266) تحت تنش خشکی توسط حسینی سالکده و همکاران (2002)به روش پروتئومیکس و ژل­های 2DE نشان داد که بعد از اعمال تنش تدریجی به مدت 23 روز، بیش از 1000 لکه پروتئینی با تکرار پذیری بالایی بر روی ژل­ها نمایش داده می­شود. از بین این پروتئین­ها، 42 لکه تغییر معنی­داری تحت اکثر تنش­ها دارد و 27 لکه از آنها الگوی پاسخ متفاوتی در ابن دو کلتیوار از خود نشان می­دهند. به هر حال، تنها یک پروتئین (سوپر اکسید دیسمیوتاز cu-zn کلروپلاست) تغییر معنی­دار با تکرار پذیری پائین، در پاسخ به تنش خشکی در دو کلتیوار دارد. اکثر تغییرات برای پروتئین­ها افزایش بیان در کلتیوار CT9993 و عدم تغییر آن در IR62266 یا کاهش بیان پروتئین­ها در اثر تنش خشکی در کلتیوار IR62266 وعدم تغییر آن در CT9993 بود.آبیاری دوباره پس از 10 روز، حاکی از بازگشت کامل پروتئین­ها و یا افزایش مقدار آن­ها در تیمار بدون تنش شده است. استفاده از تکنیک طیف سنجی جرمی (Ms) منجر به شناسایی 16 پروتئین مسئول به تنش خشکی، که عوامل دپلیمریزه کننده اکتین (ADFs)را القا می­کنند. یکی از این سه پروتئین در هر دو کلتیوار و تحت تنش خشکی مشخص شده اما در گیاهان شاهد (بدون تنش) یا در گیاهان آبیاری شده پس از 10 روزتنش مشاهده نمی­شود.

تشخیص ژن­های کاندید برای انتخاب بر اساس مارکر (MAS) می­تواند تاثیر و اهمیت بسیار بالایی در اصلاح برای فزایش مقاومت به تنش داشته باشد. تغییرات القا شده تحت تنش خشکی در پروتئوم می­تواند ژن­های با اهمیتی را مشخص کند. حاج حیدری و همکاران (2005) با تجزیه و تحلیل های پاسخ دهنده به تنش خشکی در برگ­های دو رقم چغندر­قند (69.p-7219 و 7112) که این دو رقم از نظر ماده ژنتیکی تفاوت دارند، از طریق ژل­های الکتروفورز دو بعدی، چند پروتئین با بیان متفاوت در پاسخ به تنش خشکی شناسایی کردند. در این آزمایشبیش از 500 لکه پروتئینی توسط الکتروفورز دو بعدی و تجزیه و تحلیل کمی تصاویر ژل­ها با استفاده از نرم افزار شناسایی شدند و 79 لکه تغییر معنی­دارتحت تنش خشکی نشان دادند. بعضی از پروتئین­ها با الگوی ویژه ژنتیکی افزایش یا کاهش بیان در پاسخ به تنش خشکی نشان دادند. تجزیه و تحلیل 20 لکه پروتئینی با استفاده از کارماتوگرافی فاز مایع با طیف سنجی جرمی جفتی، منجر به تشخیص روبیسکو و 11 پروتئین دیگر درگیر در تنظیم واکنش­های ردوکس، تنش اکسیداتیو، ترارسانی علامت و فعالیت چاپرون بودند. بعضی از این پروتئین­ها می­توانند در پیشرفت­های فیزیولوژی تحت تنش خشکی کمک کنند.

حسینی سالکده و همکاران (2002) با تجزیه و تحلیل پاسخ گیاهان برنج تحت تنش خشکی و شوری نشان دادند که بیش از 2000 پروتئین در برگ­ برنج­های تحت تنش خشکی و شاهد (بدون تنش) شناخته شده است. بیش از 1000 (1000<) پروتئین که قابل اعتماد بوده، حدود 42 پروتئین تغییرات معنی­دار در مقدار و یا موقعیت نشان می­دهد.همچنین چندین پروتئین که افزایش قابل توجهی در طول تنش خشکی و کمبود آب آبیاری داشتند، مشخص شدند. سه مورد از بیش­ترین و مشخص­ترینتغییرات در فاکتورهای دپلیمریزه کننده اکتین، هومولوژی ریبونوکلئازهای شبه-s و دهیدرو­آسکوربات ردوکتاز وابسته به گلوتاتیون کلروپلاستی دیده شده است. مقایسه پروتئوم زنوتیپ­های مقاوم به تنش شوری و حساس به تنش نشان از افزایش تشکیل و القای پروتئین­های مختلف در ریشه تحت تنش است. که از بین آن­ها می­توان کافئویل COA، O-متیل ترانسفراز و آنزیم بیوسنتز لیگنین را نام برد.

 تجزیه و تحلیل تنش در گیاهان حساس نقش مهمی در شناسایی ژن­های تحمل به خشکی دارد. کمال و همکاران (2010) با بررسی پروتئین­های پاسخ­دهنده به تنش خشکی در بذور چهار رقم گندم از طریق ژل­های الکتروفورز دو بعدی چندین پروتئین با بیان متفاوت در پاسخ به تنش­های غیر زنده شناسایی کردند. 58/22% از پروتئین­ها مسئول تنش­های غیر زنده در رقم China-108، 25/32% در رقم Yeonnon-78، 96/70% در رقم Norin-61 و 69.35% در رقم Kantou-107 شناسایی شدند. از کل پروتئین­های مشخص شده، 124 پروتئین به عنوان تنها پروتئین­های مسئول تنش غیر­زنده مشخص شده، که 56/31% توسط گرما، 61/26% توسط خشکی، 38/23% توسط شوری، 77/21% توسط سرما و 28/22% توسط دیگر تنش­های محیطی حاصل شده است. همچنین از بین 33 پروتئین پاسخ دهنده به تنش خشکی، 9 پروتئین در رقم China-108، 15 پروتئین در رقم Yeonnon-78، 20 پروتئین در رقم Norin-61 و 26 پروتئین در رقم Kantou107- شناسایی کردند. همچنین پروتئین­های مختلف پاسخ دهنده به آبسیزیک­اسید و پروتئین­های تاخیری جنینی ([14]LEAP) از قبیل چاپرونین، سیس پروکسی ردوکسین، پروتئین پاسخ به اتیلن، فاکتور طویل شدن TU در هر چهار رقم و همچنین پروتئین­های مشابه کینازهای وابسته به سیکلین، انگشت روی، فاکتور رونویسی مشابه MYB، پروتئین­های انتقال دهنده لیپید و WRKY را مشاهده کردند.

     تجزیه تغییرات بیان پروتئین برگ برنج تحت تنش خشکی توسط یانگ و همکاران (2010) با استفاده از روش پروتئومیکس و استفاده از ژل­های 2-DE[15] صورت گرفت و بعد از اعمال تنش به مدت 8 روز، میزان 23 پروتئین افزایش و 5 پروتئین کاهش نشان دادند. 12 پروتئین از پروتئین­های پاسخ به تنش خشکی با روش توالی­یابی یا طیف سنجی جرمی شناسایی شدند. این پروتئین­ها در متابولیسم ردوکس، فتوسنتز، دفاع، متابولیسم پروتئین و ترارسانی­علامت نقش داشتند. مطالعه تاثیر تنش­خشکی روی غلاف­برگ برنج نشان داد که سنتز فاکتور دپلیمریزه کننده اکتین در تیغه­میانی برگ، غلاف­برگ و ریشه­ها افزایش می­یابد. در این آزمایش پروتئین­های غلاف­برگ برنج به کمک الکترفورز­دو­بعدی تفکیک شدند و پس از رنگ­آمیزی ژل­ها با آبی­کوماسی، 698 لکه­ی پروتئینی شناسایی شدند. که از این تعداد، 35 لکه­ی پروتئینی 6 روز پس از اعمال تنش خشکی افزایش و یا کاهش سنتز نشان دادند (محمد علی و کوماتسو، 2006).